Estudio del papel del ácido abscísico como señal reguladora del proceso de micorrización

Resumen

La agricultura actualmente en nuestros campos es de tipo intensivo, y utiliza grandes cantidades de fertilizantes y pesticidas, provocando la eutrofización de lagos, embalses y estanques y dando lugar a una explosión de algas que suprimen otras plantas y animales acuáticos. Para evitar esto, surge entonces el concepto de nuevas prácticas ecológicas. Nuestro estudio se basa en los fertilizantes microbianos, y en este sentido, los hongos formadores de micorriza arbuscular (MA) tienen un interés máximo, puesto que forman simbiosis mutualistas con un amplio abanico de plantas de interés agronómico (Smith & Read, 1997). El establecimiento de la simbiosis MA repercute directamente en una mejor nutrición de la planta, principalmente por una mayor capacidad de captación de nutrientes minerales (esencialmente fósforo) (Holford, 1997). Pero además de su potencialidad como agentes biofertilizantes, la formación de MA incrementa la resistencia de las plantas a situaciones de estrés, tanto abiótico (sequía, salinidad, etc.,) como biótico (Pozo et al., 2002). Las señales, mecanismos y procesos moleculares que tienen lugar durante el establecimiento de la interacción son aún bastante desconocidos, si bien el resultado es una interacción compatible y mutualista. Una de las señales vegetales que participan de manera más activa en la compatibilidad y funcionamiento de la micorriza arbuscular son las hormonas vegetales, y son muchas las publicaciones científicas que apuntan a que los cambios en la homeostasis hormonal pueden ser un factor clave en la formación y funcionamiento de la simbiosis MA (Ludwig-Müller, 2010). Sin embargo, la mayoría de los estudios realizados al respecto están basados en medidas de concentración hormonal o en medidas del efecto sobre la micorrización ocasionado por el aporte exógeno de la hormona en cuestión, existiendo pocos datos sobre la función real de cada hormona y la importancia de cada una de ellas en las distintas etapas de la formación de la MA. Resultados recientes han puesto de manifiesto una clara funcionalidad del ácido abscísico (ABA) en el proceso de micorrización, siendo esencial para una correcta formación de los arbúsculos y un desarrollo normal de la colonización fúngica (Herrera-Medina et al., 2007). Estos resultados, unido al hecho de su posible acción antagónica con etileno en el proceso de micorrización, avalan la necesidad de profundizar en el estudio del ABA como modulador del proceso de formación de la MA. Por otro lado, la interacción del ABA con otras moléculas ¿señal¿, tales como el etileno (Beaudoin et al., 2000) o las giberelinas (GAs) (Kucera et al., 2005) es un hecho demostrado, tanto en procesos de desarrollo de la planta como de interacción de la misma con microrganismos patógenos, siendo además estas moléculas parte importante del puzle que supone la regulación molecular de la micorrización. Por tanto, resulta de máximo interés conocer si la función del ABA durante la formación de la MA es dependiente o independiente de la acción de estas otras moléculas. RESULTADOS OBTENIDOS Usando herramientas genéticas tales como plantas mutantes defectivas en la producción de ABA en combinación con técnicas histoquímicas y de biología molecular para el análisis de la micorrización, estudiamos la micorrización en las plantas de tomate mutantes deficientes en ABA Notabilis y Sitiens, los cuales están afectados de manera diferente en su producción en ABA y además en ambos se observa un exceso en la producción de etileno, ambos inoculados con el hongo micorrícico arbuscular Glomus irregulare. Nuestros resultados identifican diferencias en los modelos de micorrización en ambos mutantes en relación al contenido de ABA en sus raíces. Así el uso del inhibidor de ABA, tungstato sódico, provoca una reducción de la micorrización en plantas de tomate silvestres similar al mostrado por las plantas mutantes Sitiens, induciendo también un incremento del contenido de etileno en las raíces. Un estudio analítico del contenido de los diferentes metabolitos de ABA en plantas de tomate silvestres con la raíz compartimentalizada en dos macetas diferentes, en las cuales una se inoculó con el hongo micorrícico G. irregulare y el otro compartimento se quedó sin inocular. Como control se utilizó plantas de tomate, en los cuáles también se compartimentalizaron sus raíces, ambos sin micorrizar. Observando, un mayor contenido de ABA libre en las plantas micorrizadas tanto en las raíces inoculadas como no inoculadas. Mientras que los catabolitos del ABA eran mayoritarios en las raíces de plantas control sin micorrizar, salvo el 7¿-hidroxi-ABA, con cierta capacidad para inhibir la acción de las GAs. Según nuestros resultados, el ABA es importante para una correcta colonización de la planta, tanto para la formación de los arbúsculos como para la colonización de la raíz, pero también tenemos indicios de que su papel podría al menos en parte, atribuirse a la interacción antagónica con etileno. Para averiguar esto, analizamos los efectos sobre el patrón de micorrización como resultado de la inhibición de la biosíntesis de ABA en plantas de tomate con distinta concentración y sensibilidad a etileno, mediante el bloqueador tungstato sódico, que provoca un incremento del contenido de etileno en raíces. Encontramos, que en plantas con menor contenido o sensibilidad a etileno, la aplicación de tungstato sódico no provoca una reducción del grado de colonización pero si disminuye el contenido de arbúsculos y por tanto la funcionalidad de la micorrización. Mientras que plantas con una concentración normal de etileno o hipersensibles a etileno, la inhibición de ABA, provoca tanto una reducción del grado de colonización fúngica como del contenido de arbúsculos. Nuestros resultados indican que el ABA afecta positivamente a la formación de los arbúsculos, mientras que el etileno regula principalmente la tasa de colonización. Para confirmar esta hipótesis se determinó la capacidad tanto del ABA como de un inhibidor de la síntesis de etileno, Aminoetoxivinilo glicina hidroclorido (AVG), para rescatar todos los parámetros de micorrización en las plantas Sitiens. Los cuales tienen un mayor contenido en etileno, disminuyendo cuando aplicamos AVG sólo o junto con ABA. Lo que conlleva a un incremento en el desarrollo de la intensidad de la micorrización y al nivel de expresión del gen GinEF, mientras que el contenido en arbúsculos solamente se incrementan cuando aplicamos ABA sólo o junto con AVG, a estos mutantes. La expresión del gen GinGS tiene un patrón de expresión similar al mostrado por el porcentaje de arbúsculos totales en la raíz. Por tanto, podríamos concluir que el ABA regula positivamente de forma directa tanto la formación como la funcionabilidad de los arbúsculos, mientras que de forma indirecta la extensión fúngica, ya que es regulada negativamente por el etileno, el cual es inhibida su síntesis por ABA. A continuación, determinamos el papel de las GAs en el proceso de micorrización. En primer lugar realizamos un análisis de los efectos de la micorrización sobre el patrón de expresión de los genes más relevantes en el metabolismo de GAs en 3 etapas diferentes de la micorrización. En una más temprana cuantificada a los 30 días después de ser inoculadas, donde el hongo está penetrando, y existe poca micorrización y casi inexistencia de arbúsculos. En una etapa intermedia a los 44 días, ya con una mayor micorrización y ya se detectan más arbúsculos. Y en una etapa final de la micorrización a los 58 días, donde la planta ya está casi totalmente micorrizada y contiene un alto contenido en arbúsculos. En general, los genes de biosíntesis de GAs estudiados muestran una mayor expresión en las raíces de plantas micorrizadas, generalmente incrementa la acumulación de transcrito conforme se incrementa el porcentaje de la micorrización y el contenido de arbúsculos en la planta. De forma contraria, el patrón de expresión de genes de catabolismo de GAs es diferente y mucho más heterogéneo al de genes de biosíntesis, ya que en líneas generales no hay diferencias en la expresión de estos genes entre raíces de las plantas micorrizadas y no micorrizadas, salvo excepciones puntuales donde se incrementa o desciende la expresión con la micorrización, pero sin ningún patrón característico. También se detectaron cambios significativos en la expresión del gen SIDELLA, que codifica para la proteína DELLA. En este caso, el gen muestra un incremento de expresión en plantas micorrizadas conforme la micorrización avanza. Por su parte, el gen efector de GAs, GAST1, mostró un patrón de expresión con un pico de expresión en las plantas micorrizadas en la primera cosecha. Teniendo en cuenta que los genes de biosíntesis de GAs están regulados mediante un mecanismo de retroalimentación negativa por producto final, mientras que los genes de catabolismo están regulados positivamente por producto final, se puede sugerir que la concentración de GAs disminuye conforme aumenta la colonización fúngica. No obstante, esta hipótesis es muy aventurada y debería ser confirmada con un estudio analítico del contenido de GAs en las raíces de plantas micorrizadas y no micorrizadas en sus diferentes etapas de colonización. Como única referencia del contenido de GAs en las raíces micorrizadas, Shaul-Keinan y colaboradores en 2002, detectó un mayor contenido en GAs en las raíces de tabaco de plantas micorrizadas. En este sentido, los resultados de la expresión del gen SIDELLA si sugerirían un mayor contenido de GAs en las raíces con una micorrización más avanzada, pues sobre este gen las GAs ejercen un ¿feedback¿ positivo. También se realizó un análisis del efecto que ejerce sobre la micorrización la acumulación o disminución del contenido de GAs en la raíz. Para ello se aplicaron diferentes concentraciones de giberelinas 3 (GA3), y un inhibidor de giberelinas, prohexadiona cálcica (PrCa). La aplicación de GA3 no afectó a la intensidad de micorrización, pero por el contrario si disminuyó el contenido de arbúsculos en la planta desde las concentraciones más bajas, al igual que los niveles de expresión del gen GinGS. Por el contrario la aplicación del inhibidor de GAs, afecta de forma positiva a los parámetros de tasa de colonización medidos tanto por métodos histoquímicos, presentados como intensidad de micorrización, como por métodos moleculares, a partir de la expresión génica del gen GinEF. Y de igual forma, a los parámetros de eficiencia fúngica, medidos por el contenido en arbúsculos como por la expresión génica del gen GinGS. Para comprobar y determinar que efectivamente las GAs influyen negativamente en el desarrollo correcto de la micorrización, especialmente de los arbúsculos, se realizaron estudios de micorrización en plantas con un mayor contenido en GAs, utilizando plantas transgénicas CcGA20oxidasa, y plantas con una respuesta constitutiva a GAs, plantas mutantes Procera. Ambos tipos de plantas presentan fenotipos claros de respuesta a GAs. En ambas, se produce un leve descenso de la intensidad de micorrización, pero al igual que con la aplicación de GA3, las mayores diferencias se producen con el contenido de arbúsculos. Parece demostrado, pues, que un alto contenido de GAs en la planta, ya sea bien por aporte exógeno de GA3, por un incremento en la biosíntesis o respuesta de GAs, inhibe la formación de arbúsculos en las raíces de plantas de tomate inoculadas. Por lo que tanto un alto contenido en GAs como una reducción en el contenido en ABA, provocan una reducción en el contenido de arbúsculos en las raíces micorrizadas. Además teniendo en cuenta que distintos trabajos han mostrado que las GAs interactúan con el ABA de manera antagónica en multitud de procesos de desarrollo vegetal, parece lógico pensar que existen efectos coordinados y dependientes en la actuación de ABA y GAs durante el proceso de micorrización. Para dilucidar esta hipótesis, en primer lugar se analizó el efecto sobre la micorrización de la aplicación separada y conjunta de ABA y GA3 en plantas de genotipo silvestre. Se pudo comprobar una acción directa del GA3 aplicado sobre la capacidad de acumular ABA en la raíz, de tal forma que las plantas tratadas con ABA + GA3 no fueron capaces de acumular ABA libre en la raíz en igual concentración que las plantas sólo tratadas con ABA, lo que sugiere que la presencia de altas concentraciones de GA3 desvían el metabolismo del ABA hacia formas distintas al ABA libre. Además, la aplicación de GA3 tanto solo como con ABA, estuvo asociada a un incremento de la respuesta a GAs, ya que aumentó la acumulación de transcrito del gen efector de GAs en tomate, GAST1, y por el contrario la aplicación de ABA disminuía su expresión. Al determinar los datos histoquímicos de micorrización, observamos que estos tratamientos no afectan a la expansión del hongo micorrícico en la raíz. Pero cuando analizamos los parámetros de abundancia arbuscular, la aplicación GA3 de nuevo produce un descenso de estos arbúsculos. Pero de manera interesante se observó que en las plantas tratadas con ABA + GA3, si bien el ABA que la aplicación exógena de ABA, si bien no se acumuló en la raíz como ABA libre, si impide de forma parcial el efecto negativo del GA3 sobre los arbúsculos, evidenciándose una interacción antagonista entre ambas hormonas en la formación de los arbúsculos. Se determinó el efecto sobre la micorrización del ABA y del inhibidor de GAs, PrCa, en líneas de plantas mutantes Procera, que exhiben una respuesta constitutiva a GAs, que presentan un menor contenido en arbúsculos. Se observaba que la aplicación del inhibidor de GAs solamente incrementaba el contenido de arbúsculos en las plantas silvestres. Y la aplicación de ABA incrementa el contenido de arbúsculos en las plantas Procera, que alcanzó los valores registrados por las plantas silvestres. Por lo que un mayor contenido de ABA compensa el efecto negativo sobre la formación de arbúsculos ocasionado por la activación de la ruta de señalización de la respuesta a GAs en estas plantas mutantes. Sin embargo, en estos mutantes Procera la aplicación de PrCa no produjo un incremento tan acusado de estos arbúsculos, posiblemente porque en estas plantas su respuesta a GAs no es por un exceso en el contenido en GAs. Por tanto y para confirmar esta hipótesis de regulación de la formación de arbúsculos mediante un balance del contenido de estas dos hormonas, se determinó como afectaban las GAs al desarrollo de micorrización en plantas mutantes Sitiens, deficientes en ABA, en las cuáles había una menor micorrización. En primer lugar se cuantificó la cantidad de transcrito de los genes del metabolismo de GAs en las raíces de estas plantas Sitiens y en sus silvestres micorrizados y no micorrizados. Donde los genes de biosíntesis generalmente se expresan más en las raíces micorrizadas de plantas silvestres. Por el contrario, los genes de catabolismo, tienen una tendencia a incrementar su expresión en plantas mutantes Sitiens micorrizadas. Así, el gen de respuesta de GAs, GAST1, tiene una mayor expresión en las plantas Sitiens tanto micorrizadas como sin micorrizar. En este sentido, los resultados de expresión génica mencionados apuntan a un incremento de los niveles de GAs en plantas Sitiens, en base a la activación de los genes de catabolismo y de respuesta a GAs, GAST1, ambos regulados positivamente por GAs. Para profundizar en la interacción antagonista ABA-GAs durante el proceso de micorrización se realizó un experimento en plantas mutantes Sitiens, aplicándoles tanto ABA como el inhibidor de GAs, para determinar los efectos sobre la micorrización. Igual que anteriormente, el GA3 afecta de forma negativa a la capacidad de acumular ABA libre a la raíz. Por otro lado, el inhibidor de GAs, también produce un leve incremento del contenido de ABA en raíces. Al determinar los parámetros de expansión fúngica, observamos que la frecuencia de micorrización, que son los fragmentos de raíces micorrizados, y de intensidad de la micorrización, se ven incrementados en estas plantas Sitiens tanto con la aplicación de ABA como del inhibidor de GAs, aplicados solos o en combinación con GA3. Pero por el contrario, la aplicación única de GA3 en plantas Sitiens, disminuye la frecuencia de fragmentos micorrizados, pero no la intensidad de micorrización. Estos datos histoquímicos de intensidad de micorrización están en concordancia con los resultados moleculares obtenidos a partir de la determinación de la expresión génica del gen GinEF. Por otro lado, el contenido de arbúsculos es incrementado tanto aplicando ABA como PrCa, y cuando aplicamos GA3 ese efecto positivo revierte. Estos datos de intensidad de micorrización y arbúsculos en fragmentos de raíz micorrizado, deriva en el contenido de arbúsculos en el total de la raíz, que muestra un patrón similar al mostrado por el patrón de expresión génica del gen GinGS. Además se determinó el porcentaje de arbúsculos con diferente morfología, observando que los arbúsculos con un menor grado de desarrollo eran mayoritario en plantas Sitiens sin tratar o tratadas con GA3, mientras que el número de arbúsculos totalmente formados que ocupan la totalidad de la célula y con una mayor funcionalidad, son mayoritario en estas plantas Sitiens tratadas bien con ABA o bien con PrCa, disminuyendo esa proporción cuando se aplican con GA3. El número de arbúsculos con un grado de desarrollo intermedio, fue similar en todos los tratamientos. Por tanto, con todos estos resultados podemos decir que los efectos negativos de la deficiencia de ABA, se recuperan tanto aplicando ABA exógeno como mediante inhibición de la síntesis de GAs. CONCLUSIONES 1. El mantenimiento de niveles fisiológicos de Ácido Abscísico (ABA) en la raíz es condición necesaria para una correcta formación de Micorriza Arbuscular en plantas de tomate (Solanum lycopersicum). 2. La formación de Micorriza Arbuscular en tomate altera el metabolismo del ABA en la raíz, disminuyendo la presencia de ABA-glucosidado y catabolitos derivados de la hidroxilación en C8¿ y C9¿ del ABA, e incrementando los niveles de ABA libre y 7¿-OH-ABA, derivado de la hidroxilación en C7¿. 3. Existe un doble mecanismo, dependiente e independiente de la acción del etileno, asociado con la función del ABA durante la formación de la Micorriza Arbuscular en tomate. El ABA es necesario para la formación de arbúsculos, y la deficiencia de ABA tiene un efecto negativo directo sobre el porcentaje de arbúsculos. A su vez, la deficiencia de ABA incrementa el contenido en etileno que funciona como un regulador negativo de la intensidad de la micorrización. 4. Las Giberelinas (GAs) son compuestos reguladores de la formación de la Micorriza Arbuscular en tomate. El grado y tipo de alteración de los parámetros de micorrización debido a la alteración en la percepción o concentración de GAs en la raíz, sugiere una acción reguladora negativa de GAs sobre la abundancia arbuscular y la frecuencia de micorrización. 5. La formación de Micorriza Arbuscular en tomate altera el patrón de expresión de genes del metabolismo y genes efectores de la acción de GAs en la raíz. De manera generalizada la micorrización promueve la expresión de genes de biosíntesis y respuesta a GAs, y disminuye la expresión de genes del catabolismo de GAs. 6. La regulación de la formación de los arbúsculos en raíces de plantas de S. lycopersicum colonizadas por G. irregulare depende de la interacción entre ABA y GAs, de tal forma que coexisten efectos antagonistas y dependientes de la acción de estas hormonas, correlacionándose la incapacidad para formar los arbúsculos con el desequilibrio en la relación ABA/GAs de la raíz.