Microspore embryogenesis induction in hot pepper genotypes

Resumen

El pimiento (Capsicum annuum) es una especie ampliamente utilizada y cultivada tanto en campo abierto como en invernadero. En particular, el pimiento picante tiene una gran variedad de aplicaciones tanto alimentarias como farmacéuticas por lo que su interés económico crece día a día. La inducción de la embriogénesis de las microsporas mediante el cultivo de anteras y de microsporas aisladas es una herramienta biotecnológica muy poderosa en la mejora de plantas a través de la producción de plantas doble-haploides de una forma rápida y eficaz. Sin embargo, en el pimiento picante sólo se ha conseguido inducir la embriogénesis mediante cultivo de anteras o de microsporas en un número muy reducido de genotipos. El objetivo principal de esta tesis ha sido el desarrollo de un protocolo eficiente para la inducción embriogénica mediante cultivo de anteras y microsporas aisladas en pimiento picante. Así mismo, se ha realizado el análisis de los cambios morfológicos e histoquímicos producidos durante este proceso. Para ello, se analizaron y optimizaron distintos protocolos de cultivo de anteras y de microsporas aisladas. Además, se realizó un estudio celular e histoquímico al microscopio óptico de microsporas y anteras en distintas fases de la embriogénesis. Este trabajo se llevó a cabo en cuatro genotipos (3 picantes: Serrano, Jalapeño y CM334 y 1 dulce: Lamuyo) seleccionados de entre los disponibles en Monsanto, empresa en colaboración con la cual se desarrolló esta tesis. Con los procedimientos ensayados se pudo comprobar la gran influencia que el genotipo tiene en el proceso de inducción de la embriogénesis tanto mediante el cultivo de anteras como de microsporas aisladas. Se comprobó así mismo que las anteras de los genotipos picantes sufrían una considerable oxidación durante el cultivo que podía evitarse mediante el uso de carbón activo que además estimulaba la producción de embriones en el genotipo dulce. Aunque inicialmente se probaron los procedimientos adaptados para genotipos picantes los resultados más eficientes para el cultivo de anteras se obtuvieron con un procedimiento que optimizamos a partir del de McComb y McComb (1977), que había sido empleado con éxito en otra Solanácea. Este procedimiento (MC1) en el que hemos reducido la concentración del carbón activo y sustituido la sacarosa por maltosa como fuente de carbono no incluye el uso de hormonas. Este método sencillo, repetitivo y económico no requiere de subcultivos que compliquen el procedimiento y aumenten el riesgo de contaminación de las anteras. En el genotipo Serrano, el que mejor responde con este método, produce más de 10 embriones perfectos por cada 100 anteras cultivadas. En cuanto a la embriogénesis inducida mediante cultivo de microsporas aisladas, los mejores procedimientos son los que utilizan el método de aislamiento de las microsporas de Soriano et al. (2008) optimizados utilizando los medios de cultivos y pretratamientos del MC1. Con este método de aislamiento tanto el procedimiento que adicionan n-butanol en el pretratamiento como el que no incluye este alcohol los mejores resultados se obtuvieron en el genotipo Serrano con alrededor de 5 embriones por cada 100 anteras. El análisis celular de la embriogénesis inducida mediante cultivo de anteras y microsporas aisladas mostró que uno de los primeros signos de inducción embriogénica era el aumento del tamaño de las microsporas, sin embargo dicho aumento no garantizaba la producción de embriones. Además, se comprobó que dicha inducción produce divisiones simétricas y asimétricas en la microsporas siendo las primeras más abundantes. Por primera vez se ha descrito la formación de estructuras semejantes al suspensor en los embriones inducidos tanto mediante el cultivo de anteras como el de microsporas aisladas en genotipos de pimiento dulce y picante.