Estudio de la respuesta de pseudomonas syringae pv. Tomato dc3000 a flavonoides

Resumo

Las plantas responden activamente al estrés causado por heridas provocadas por daño mecánico o por el ataque de insectos o microorganismos, produciendo fitoalexinas y otros metabolitos que pueden inducir la producción de compuestos protectores, ya sea en el sitio de la lesión o sistémicamente en tejidos no afectados. Los flavonoides son algunos de los metabolitos secundarios de plantas más abundantes que pueden disuadir a los microorganismos o actuar como agentes anti-infección, ya que suprimen la virulencia bacteriana y tienen actividad antimicrobiana. Sin embargo, las bacterias han desarrollado mecanismos de resistencia frente a estos compuestos. Uno de los más eficientes es la eliminación activa de compuestos tóxicos con estructuras químicas diferentes mediante unos transportadores de membrana denominados también bombas. El presente trabajo de tesis se ha centrado en el estudio de P. syringae pv. tomato DC3000, bacteria causante de la mancha negra del tomate y patógena de la planta modelo A. thaliana. Pto DC3000 es utilizada como modelo para el estudio de la interacción patógeno-hospedador y la secuenciación de su genoma ha permitido el estudio de distintas funciones de interés. DC3000 posee un amplio repertorio de sistemas de transporte, de los cuales 12 están anotados como transportadores pertenecientes a la familia RND (Resistance, Nodulation, Cell division). Aunque se ha demostrado la existencia y el papel de transportadores RND en algunas bacterias fitopatógenas, la función de los mismos y sobre todo su regulación, estaba menos estudiada en P. syringae al inicio de este trabajo de tesis. Por tanto, el objetivo principal de esta tesis ha sido el estudio de la respuesta de Pto DC3000 a flavonoides producidos por las plantas con el propósito de determinar el papel del sistema PmeR/MexAB-OprM en la resistencia de esta bacteria a los mismos, estudiando la regulación génica del sistema PmeR/MexAB-OprM y caracterizando bioquímica y funcionalmente la proteína reguladora PmeR. Además, se ha investigado el efecto de los flavonoides sobre la motilidad y el sistema de secreción tipo III de Pto DC3000. En primer lugar, se estudió el papel de la bomba de eflujo MexAB-OprM como mecanismo de defensa de Pto DC3000 frente a flavonoides, demostrando que está implicada en la resistencia intrínseca de DC3000 a un amplio rango de compuestos. Hemos estudiado la expresión del operón mexAB-oprM y del gen regulador, pmeR, así como el papel de la proteína PmeR en la transcripción de ambos operones. mexAB-oprM y pmeR se expresan in vivo a un nivel basal elevado y moderado, respectivamente, y la presencia de diferentes flavonoides y otros compuestos antimicrobianos provoca un aumento de la expresión de ambos. Los resultados demuestran que PmeR es el represor local del promotor de mexAB-oprM y que también regula su propia expresión uniéndose a un operador pseudopalindrómico que solapa con ambos promotores. PmeR modula la expresión de mexAB-oprM y pmeR al unirse a flavonoides, lo que provoca un cambio conformacional en la proteína que interfiere con su unión al ADN. Por último y mediante experimentos in planta, hemos demostrado que el sistema PmeR/MexAB-OprM contribuye a la supervivencia y a la colonización de las plantas de tomate. En segundo lugar, se estudió la acción de los flavonoides sobre algunos factores de virulencia de Pto DC3000 que son claves en la interacción planta-patógeno. En Pto DC3000 los flavonoides disminuyen la motilidad tipo swimming y tipo swarming y causan la pérdida de flagelos porque inhiben la expresión de FliC. Además, la expresión y el ensamblaje de un sistema de secreción tipo III funcional se reduce en presencia de floretina porque provoca un descenso en los niveles de ARNm de hrpL. En P. syringae la ruta de señalización Gac-Rsm controla diferentes procesos bacterianos. En presencia de floretina, los niveles del ARN regulador rsmY disminuyen claramente en la cepa silvestre, pero no en un mutante en gacA. Todos estos resultados sugieren que la floretina inhibe la función del sistema de transducción de señal GacS/GacA, causando una disminución del ARN rsmY, lo que afecta a la síntesis de dos factores de virulencia importantes de Pto DC3000, los flagelos y el sistema de secreción tipo III. Los resultados obtenidos en esta tesis indican que Pto DC3000 posee un mecanismo a prueba de fallos para superar las defensas del hospedador, ya que detecta y responde a los flavonoides por, al menos, una vía de señalización (Gac-rsm) y dos cascadas de expresión génica (flagelos y T3SS), induciendo al mismo tiempo la expresión del sistema MexAB-OprM. Por tanto, los flavonoides actúan como moléculas señal en la interacción planta-patógeno.