Caracterización de elementos estructurales y reguladores de la formación de biofilms de pseudomonas putida

Resumen

En el ambiente las bacterias se encuentran predominantemente formando comunidades microbianas adheridas a una gran variedad de superficies, formando lo que se conoce como biopelículas o biofilms (Costerton, 1999). Aunque estas comunidades microbianas suelen estar formadas por multitud de especies, para su estudio en el laboratorio se ha simplificado el modelo utilizando mayoritariamente biofilms monoespecíficos. Esto ha permitido profundizar en el conocimiento de los determinantes moleculares implicados en el desarrollo de un biofilm que han resultado ser sorprendentemente específicos. La estrategia de vida en forma de biofilm aporta numerosas ventajas adaptativas a las bacterias, en cuanto a la colonización y persistencia en distintos ambientes. A grandes rasgos, la formación de un biofilm confiere mayor resistencia a una gran variedad de factores ambientales como la desecación, radiación ultravioleta, moléculas con actividad antimicrobiana y protección frente al sistema inmune. Estas ventajas suponen numerosos problemas a la hora de la erradicación de biofilms bacterianos no deseados en superficies como el instrumental hospitalario (sondas, catéteres, campanas de oxígeno, etc.), lugares de procesado en la industria alimentaria y plantas purificadoras de agua. Uno de los casos más estudiados es la colonización de tejido pulmonar en pacientes enfermos de fibrosis quística por numerosas especies bacterianas entre ellas Pseudomonas aeruginosa, que es capaz de establecerse en forma de biofilms y provocar infecciones crónicas (Costerton et al., 1995); los tratamientos con antibióticos son bastante ineficaces debido a la elevada resistencia que presenta P. aeruginosa en forma de biofilms. Sin embargo, el estudio de los biofilms tiene un lado positivo en el que el establecimiento de biofilms bacterianos puede aportar numerosos beneficios. Este es el caso de la colonización de superficies vegetales por parte de bacterias protectoras frente a fitopatógenos, donde se ha visto que la formación de biofilms es clave para que ejerzan su papel protector (Chen et al., 2012) y del uso de biofilms para el tratamiento de aguas residuales (Nicolella et al., 2000). Una característica muy importante de esta forma de vida sésil, que la diferencia de la vida planctónica, es la producción de una matriz extracelular producida por las células bacterianas y en la que ellas mismas se encuentran embebidas. Se han sugerido numerosas funciones para la matriz extracelular, entre ellas que ejerce un papel protector frente a multitud de amenazas ambientales y por otro lado permite el desarrollo de comunidades estructuralmente complejas. Su composición es muy variable según la especie bacteriana aunque generalmente está constituida por proteínas, exopolisacáridos y ADN. Esta Tesis Doctoral se ha centrado en el estudio de la formación y regulación de biofilms bacterianos usando como modelo Pseudomonas putida KT2440. P. putida KT2440 es una bacteria ubicua que coloniza eficientemente la rizosfera de diversas plantas con un elevado interés agroalimentario. Esta bacteria es capaz de activar la resistencia sistémica inducida frente a patógenos y promover el crecimiento de la planta. Trabajos previos en el grupo han permitido la identificación de numerosos determinantes moleculares implicados en la adhesión a semillas y estudios transcriptómicos han revelado la existencia de genes que se expresan preferentemente en la rizosfera (Matilla et al., 2007, Yousef-Coronado et al., 2008, Espinosa-Urgel et al., 2000). Uno de esos trabajos permitió el aislamiento de numerosos mutantes afectados en la adhesión a semillas a los que se denominó mus, mutants unattached to seeds (Espinosa-Urgel et al., 2000). Uno de los mutantes, mus-20, afectado en el gen PP_0806 que codifica una supuesta proteína de superficie de gran tamaño a la que se le ha llamado LapF, ha sido uno de los principales objetos de estudio en esta Tesis Doctoral. En el capítulo ¿LapF, the second largest Pseudomonas putida protein, contributes to plant root colonization and determines biofilm architecture¿ se ha estudiado el papel de LapF en la colonización de la rizosfera de plantas de maíz y alfalfa así como la localización de la proteína y su contribución en la formación de biofilms de P. putida KT2440. El gen PP_0806 codifica una proteína de 6.310 aminoácidos que puede ser dividida en 3 dominios principales. El domino N-terminal comprende los primeros 152 aminoácidos, seguido del segundo dominio que corresponde al 85% de la proteína y está formado por 64 repeticiones imperfectas cada una de 85-91 aminoácidos cada una. El dominio C-terminal está compuesto por 691 aminoácidos; es un dominio putativo de unión a calcio y contiene dos dominios GGXGXD característicos de proteínas secretadas por sistemas de secreción Tipo I. Se han llevado a cabo numerosas técnicas de formación de biofilm con las que se ha demostrado la implicación de LapF en etapas tardías del desarrollo del mismo: formación de microcolonias y un biofilm maduro. Un mutante afectado en lapF es además menos competitivo en colonización de la rizosfera de maíz y alfalfa en comparación con la cepa salvaje. Mediante la utilización de diversas técnicas se ha demostrado la localización subcelular de LapF en la superficie bacteriana y entre células formando parte de las microcolonias dentro de un biofilm. El patrón de expresión del promotor de lapF tanto en cultivos líquidos como en biofilms es característicamente de fase estacionaria y se ha demostrado que su expresión es dependiente del factor de transcripción alternativo RpoS. Los resultados obtenidos en este capítulo han permitido proponer el rol de LapF en la formación de microcolonias de P. putida KT2440 probablemente estableciendo interacciones célula a célula y permitiendo el desarrollo de un biofilm maduro. En el siguiente capítulo, ¿Calcium causes multimerization of the large adhesin LapF and modulates biofilm formation by Pseudomonas putida¿ se ha estudiado el papel del calcio en la formación de biofilms de P. putida y en la funcionalidad de LapF a través de su dominio C-terminal. Como se ha mencionado anteriormente, LapF está constituida por 3 dominios diferentes, encontrándose dos supuestos motivos de unión a calcio en el dominio C-terminal de la proteína. Tras la purificación del dominio C-terminal de LapF (CLapF), se ha confirmado mediante ITC (Isothermal Titration Calorimetry) la unión específica de calcio por parte de CLapF. Así mismo, se ha demostrado por medio de distintas técnicas (DLS ¿Dynamic Light Scattering¿, FPLC analítico y microscopía electrónica de transmisión) la tendencia de la proteína a formar grandes agregados en presencia de calcio. Mediante técnicas de inmunolocalización con microscopía electrónica de transmisión se ha estudiado con mayor detalle la localización de LapF en el biofilm, donde se ha detectado la presencia de agregados de LapF entre células. Los resultados obtenidos en este capítulo nos han llevado a proponer un modelo de acción en el que LapF mediaría la unión célula a célula mediante su dominio C-terminal y a través del calcio. En el siguiente capítulo, ¿Expression of the large Pseudomonas putida adhesins LapA and LapF is part of a complex global regulatory network governing biofilm formation¿ se ha profundizado en la regulación de las dos adhesinas claves en la formación de biofilms de P. putida, LapA y LapF. El primer capítulo de esta tesis da pie a la propuesta de un modelo secuencial de formación de biofilm de P. putida. Este modelo sugiere que LapA (la primera adhesina identificada en P. putida) es esencial para la primera etapa de la formación de un biofilm, la unión irreversible al sustrato (Hinsa et al., 2003) mientras que LapF es clave para el proceso de desarrollo de microcolonias y la maduración del biofilm. En este capítulo se compara el patrón de expresión de lapA y lapF tanto en cultivos planctónicos como en biofilms. Se ha demostrado que ambas adhesinas están bajo la regulación del sistema de dos componentes GacS/GacA pero tan solo lapF es dependiente del factor de transcripción RpoS. Igualmente se ha demostrado la influencia de altos niveles intracelulares del segundo mensajero di-GMPc en la expresión de ambas adhesinas tanto a través del ¿master regulator¿ del flagelo, FleQ, como en una ruta independiente. Los resultados de este capítulo apoyan el modelo secuencial propuesto anteriormente para la formación de biofilms de P. putida y así mismo proponen un modelo de regulación transcripcional independiente para lapA y lapF. Recientemente y en paralelo al transcurso de esta Tesis Doctoral se han identificado 4 operones implicados en la síntesis de cuatro exopolisacáridos diferentes y se ha sugerido su participación en la estabilidad del biofilm de P. putida KT2440 (Nilsson et al., 2011). En el último capítulo de resultados de esta Tesis Doctoral ¿Compensatory balance between extracellular matrix components of Pseudomonas putida biofilms¿ nos hemos centrado en estudiar cómo la ausencia de determinados componentes de la matriz extracelular de P. putida provoca una alteración a nivel transcripcional de la expresión de los componentes restantes. En este capítulo hemos demostrado que la ausencia de alguna de las dos adhesinas principales, LapA o LapF provoca una alteración en la producción de exopolisacáridos. Se ha estudiado el efecto de altas concentraciones del segundo mensajero di-GMPc en la producción de los distintos componentes de la matriz extracelular y se ha observado el fenotipo de mutantes afectados en LapA o LapF en estas condiciones, lo que sugiere una relación directa entre adhesinas y exopolisacáridos. Finalmente se propone que todos los elementos implicados en la matriz extracelular, tanto exopolisacáridos como adhesinas, están íntimamente regulados de una manera ¿alostérica¿ de modo que se asegura la habilidad de la bacteria para establecer interacciones célula-célula. Esta Tesis Doctoral aporta información clave del proceso de formación de biofilms por parte de P. putida KT2440 que ha permitido la propuesta de un modelo secuencial de la formación de biofilms. Así mismo introduce nuevos componentes en cuanto a la regulación transcripcional de los factores claves de la matriz extracelular y en el que se propone un modelo de regulación que sugiere una relación estrecha entre todos los componentes de la matriz extracelular del biofilm de P. putida KT2440. Referencias bibliográficas Costerton, J. W., (1999) Introduction to biofilm. International Journal of Antimicrobial Agents 11: 217-221. Costerton, J. W., Z. Lewandowski, D. E. Caldwell, D. R. Korber & H. M. Lappin-Scott, (1995) Microbial Biofilms. Annual Review of Microbiology 49: 711-745. Chen, Y., F. Yan, Y. Chai, H. Liu, R. Kolter, R. Losick & J.-h. Guo, (2012) Biocontrol of tomato wilt disease by Bacillus subtilis isolates from natural environments depends on conserved genes mediating biofilm formation. Environmental Microbiology: In press. Espinosa-Urgel, M., A. Salido & J. L. Ramos, (2000) Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to Seeds. 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