Neuropathic pain induced by paclitaxelrole of voltage-gated sodium channels and sigma-1 (¿1) receptors

Resumen

1. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS La aparición de dolor en pacientes cancerosos se debe tanto a la enfermedad como a algunos de los tratamientos que reciben. La mayoría de los fármacos antineoplásicos más eficaces (taxanos, alcaloides de la Vinca y derivados del platino) producen neuropatías periféricas que se caracterizan por una disfunción sensorial y dolor, que con frecuencia son factores limitantes del tratamiento (Sul y Deangelis, 2006; Park et al., 2008; Paice, 2010). La incidencia y gravedad de la neuropatía dolorosa depende, entre otros factores, del agente antineoplásico, de la pauta de administración y de la dosis acumulada (Gutiérrez-Gutiérrez et al., 2010). Estos fármacos antineoplásicos son el tratamiento de elección para un gran número de tumores sólidos y linfoides, por lo que cientos de miles de pacientes son afectados por estas neuropatías cada año, lo que constituye un grave problema para el que todavía no hay soluciones efectivas (Cleeland et al., 2010; Gutiérrez-Gutiérrez et al., 2010). Dentro del grupo de los taxanos, el paclitaxel (Taxol®) es uno de los fármacos antineoplásicos más usados para el tratamiento del cáncer de mama y de ovario, entre otros (Balayssac et al., 2011; Argyriou et al., 2008). Los pacientes tratados con paclitaxel con frecuencia desarrollan una neuropatía sensorial que usualmente comienza de forma simétrica en los pies o en los pies y en las manos (con una distribución en forma de guante-calcetín), y que se manifiesta por parestesias, sensación de entumecimiento y hormigueo y dolor neuropático, (Dougherty et al., 2004; Jung et al., 2005; Argyriou et al., 2008). Desgraciadamente, no hay tratamientos sintomáticos o preventivos clínicamente eficaces (Argyriou et al., 2008), aunque se han desarrollado modelos de neuropatías inducidas por paclitaxel en roedores, que hacen posible probar tratamientos experimentales y clarificar su patogénesis (por ejemplo: Dina et al., 2001; Flatters and Bennett, 2004; Liu et al., 2010). Estos modelos experimentales han demostrado que la administración repetida o aguda de paclitaxel a roedores produce hiperalgesia y/o alodinia a estímulos fríos, mecánicos y/o calientes (revisado en Authier et al., 2009). La mayoría de los modelos de esta neuropatía descritos previamente se habían caracterizado en ratas macho; sin embargo, el paclitaxel es fundamentalmente usado en mujeres (Rowinsky, 2010). Además, gran parte de los modelos de modificación genética para eliminar o sobreexpresar una determinada diana se desarrollan en ratones. Por tanto, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue desarrollar un modelo experimental de dolor neuropático inducido por paclitaxel en ratones hembra, y evaluar diferentes dianas terapéuticas potenciales en este modelo (mediante diversos abordajes experimentales, tales como estudios comportamentales y morfológicos). Los canales de sodio dependientes de voltaje juegan un papel clave en la función neuronal en condiciones fisiológicas y patológicas (revisado por Dib-Hajj et al., 2010; Liu y Wood, 2011). Se han descrito alteraciones en la expresión de algunos de estos canales en neuronas sensoriales que contribuyen al dolor inflamatorio y neuropático (Lai et al., 2004; Wood et al., 2004; Amir et al., 2006). En concreto, se ha descrito que los canales de sodio sensibles a tetrodotoxina (TTX) están aumentados en neuronas nociceptivas de los ganglios de las raíces dorsales (Dib-Hajj et al. 1999; Black et al., 1999; Kim et al., 2001; Hong et al., 2004), del asta dorsal de la médula espinal (Hains et al., 2003, 2004) y núcleos talámicos (Zhao et al., 2006) en diferentes modelos de dolor neuropático. Esta regulación al alza de los canales de sodio sensibles a TTX produce cambios electrofisiológicos, como una respuesta exagerada de las neuronas a ciertos estímulos, y cambios comportamentales, como un incremento del dolor (Rizzo et al., 1995; Cummins and Waxman, 1997; Black et al., 1999; Hains et al., 2004; Zhao et al., 2006). Por tanto, podría ser de interés terapéutico para controlar el dolor neuropático un fármaco que pudiera bloquear selectivamente estos subtipos de canales de sodio, y la TTX tiene este perfil. La administración de TTX reduce las descargas ectópicas espontáneas y el dolor neuropático en ciertos modelos experimentales de ligadura de nervio periférico (Omana-Zapata et al., 1997; Lyu et al., 2000; Liu et al., 2001; Xie et al., 2005; Marcil et al., 2006). Sin embargo, la contribución de los canales de sodio sensibles a TTX, a la neuropatía dolorosa inducida por antineoplásicos nunca había sido investigada. En consecuencia, el primer objetivo específico de esta Tesis Doctoral, fue examinar el efecto del bloqueo de los canales de sodio sensibles a TTX en el dolor neuropático inducido por paclitaxel. Para ello, se evaluaron los efectos de la administración sistémica de dosis bajas de TTX en la expresión del dolor neuropático inducido por paclitaxel, una vez que la neuropatía estaba plenamente instaurada en los ratones. Además, puesto que hay precedentes de que el bloqueo de los canales de sodio durante la fase de inducción del dolor neuropático (en modelos de lesión mecánica), podría modificar el desarrollo de la neuropatía (Xie et al., 2005), también se probó el efecto preventivo de TTX, administrándola durante la fase de desarrollo del dolor neuropático inducido por paclitaxel. Se han caracterizado dos subtipos de receptores sigma (¿), denominados ¿1 y ¿2, aunque solo el receptor ¿1 ha sido clonado en humanos y roedores (revisado por Cobos et al., 2008; Maurice y Su, 2009). Los receptores ¿1 están ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central, incluidas áreas importantes para el procesamiento del dolor (Alonso et al., 2000; Kitaichi et al., 2000). Actualmente hay numerosas evidencias de que los receptores ¿1 participan en la modulación del dolor (Cendán et al., 2005a; Cendán et al., 2005b; Kim et al., 2006; Entrena et al., 2009a; Entrena et al., 2009b), especialmente cuando participa el proceso de sensibilización central (Drews and Zimmer, 2009). Recientemente, se ha demostrado que los ratones knockout ¿1 (¿1-KO) y que ratas tratadas con un antagonista ¿1, tienen reducido el dolor neuropático inducido por lesión mecánica del nervio ciático, en paralelo con una reducción de la fosforilación de la subunidad 1 del receptor de NMDA y de la fosforilación de ERK en el asta dorsal de la médula espinal (Roh et al., 2008; De la Puente et al., 2009), que son eventos importantes en el proceso de sensibilización central (Latremoliere and Woolf, 2009). Por tanto, los receptores ¿1 parecen tener un papel relevante en el proceso de sensibilización central y en ciertos modelos de dolor neuropático. Sin embargo, hasta el momento, ningún estudio ha evaluado el papel del receptor ¿1 en ciertas neuropatías dolorosas de alta prevalencia como las neuropatías inducidas por la diabetes, por una infección por el virus del herpes o por fármacos antineoplásicos. En consecuencia, el segundo objetivo específico de esta Tesis Doctoral fue comprobar el papel del receptor ¿1 en el dolor neuropático inducido por el antineoplásico paclitaxel. Para conseguir este objetivo, se evaluó si la administración sistémica de antagonistas del receptor ¿1 era capaz de inhibir la expresión de los signos del dolor neuropático inducido por paclitaxel. Además, puesto que el bloqueo farmacológico o la inactivación genética del receptor ¿1, impide el desarrollo de dolor neuropático inducido por lesión mecánica nerviosa, también evaluamos si los antagonistas ¿1 administrados preventivamente o los animales sin el receptor ¿1 (¿1-KO) desarrollaban el dolor neuropático inducido por paclitaxel. En los últimos años, se han hecho grandes progresos en el conocimiento de la fisiología del receptor ¿1. Hoy se sabe que este receptor es una chaperona regulada por ligando, que se localiza en el retículo endoplasmático (Hayashi y Su, 2007) y se ha propuesto que es un modulador de varios receptores y canales iónicos (Maurice and Su, 2009). Normalmente el receptor ¿1 se localiza en una región del retículo endoplasmático relacionada funcionalmente con la mitocondria (mitochondrion-associated endoplasmic reticulum membrane, MAM), donde realiza su función de chaperona, ayudando al plegamiento de ciertas proteínas, con lo que modula el nivel del Ca2+ intramitocondrial, jugando un papel clave en el control de la homeostasis del Ca2+ celular (Su et al., 2010). Por otro lado, se ha descrito un incremento en la incidencia de mitocondrias hinchadas y/o vacuolizadas en nervios periféricos sensoriales, que parecen ser relevantes para la patogénesis del dolor neuropático inducido por paclitaxel (Flatters y Bennett, 2006; Jin et al., 2008; Bennett, 2010). Se ha sugerido que tal incremento de mitocondrias atípicas se debe a la unión del paclitaxel con la ß-tubulina asociada a la mitocondria, lo que produciría la liberación del Ca2+ almacenado en la misma y en consecuencia un desajuste de la homeostasis del Ca2+ celular (Flatters y Bennett, 2006; Siau y Bennett, 2006). Cabe destacar que alteraciones en la función mitocondrial y/o en los niveles del Ca2+ intracelular pueden afectar la excitabilidad de la membrana, la liberación de neurotransmisores y otros eventos celulares, que podrían contribuir a la neuropatía diabética (Verkhratsky y Fernyhough, 2008) y a otras neuropatías periféricas (Fernyhough y Calcutt, 2010). Dado que los receptores ¿1 participan en la regulación del Ca2+ mitocondrial y celular, parece interesante investigar si los efectos beneficiosos del bloqueo de los receptores ¿1 en el dolor neuropático inducido por paclitaxel están asociados a una reducción de las atipias mitocondriales inducidas por el antineoplásico, lo cual constituye el tercer objetivo específico de esta Tesis Doctoral. Para alcanzar dicho objetivo, se examinaron, con microscopía electrónica de transmisión, las características de las mitocondrias de los nervios safenos en días claves del curso temporal del dolor neuropático inducido por paclitaxel. Además, se estudió si el bloqueo farmacológico (antagonistas ¿1) o la inactivación genética (ratones ¿1-KO) del receptor ¿1, podrían prevenir los cambios mitocondriales inducidos por la administración de paclitaxel. 2. MÉTODOS 2.1. Animales de experimentación Todos los experimentos fueron realizados en ratones hembra de la cepa CD-1 (Charles River, Barcelona, España) con un peso de 25-30 g. Para obtener los ratones ¿1-KO de la cepa CD-1, los animales previamente generados por Langa y colaboradores (2003) fueron cruzados durante 10 generaciones con ratones CD-1 puros, asegurando de esta manera una pureza de la cepa CD-1 de al menos un 99% (Wong et al., 2002); los ratones portadores de la mutación fueron posteriormente cruzados hasta obtener individuos knockout homocigotos, los cuales fueron utilizados en el curso de esta Tesis Doctoral. Los ratones fueron manipulados de acuerdo con la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/ECC). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad de Granada. 2.2. Experimentos in vivo Modelo experimental de dolor neuropático inducido por paclitaxel: protocolo y consideraciones generales El paclitaxel (Taxol®) fue preparado para obtener una solución madre de 6 mg/ml en un solvente compuesto por 50% de Cremophor EL y 50% de etanol absoluto. Esta solución de paclitaxel fue diluida en salino, inmediatamente antes de la administración, hasta una concentración final de 0,2 mg/ml. El vehículo del paclitaxel también fue diluido con salino, justo antes de la inyección, en la misma proporción que la solución de paclitaxel. El paclitaxel (2 mg/kg) fue administrado intraperitonealmente (i.p.), en un volumen de 10 ml/kg, una vez al día durante cinco días consecutivos. Por tanto, la dosis acumulada fue de 10 mg/kg por ratón, dosis que producía una neuropatía dolorosa en ratas en otros estudios (Dina et al., 2001, 2004). En el grupo control el vehículo del paclitaxel fue administrado igualmente en un volumen de 10 ml/kg, una vez al día durante cinco días sucesivos. El procedimiento general para comprobar que el paclitaxel producía dolor neuropático fue el siguiente. Se tomaron respuestas basales de cada animal en cada test nociceptivo, antes del comienzo del tratamiento con el antineoplásico o su vehículo (medidas pretratamiento). A continuación, 3 días después de las medidas pretratamiento, los animales recibieron una inyección al día de paclitaxel o su vehículo durante 5 días consecutivos (fase de tratamiento). Posteriormente, la respuesta de cada animal en cada test nociceptivo fue nuevamente evaluada (medidas postratamiento), durante 2 ó 3 semanas (dependiendo del test) después del tratamiento con el antineoplásico o su vehículo. En los experimentos en los que se emplearon ratones ¿1-KO se siguió el mismo procedimiento. Los efectos de la administración subcutánea (s.c.) del bloqueante de los canales de sodio dependientes de voltaje TTX, y de los antagonistas selectivos del receptor ¿1 (BD-1063 y S1RA) en el dolor neuropático inducido por paclitaxel fueron examinados de dos formas diferentes. Para evaluar el efecto de estos fármacos en el desarrollo del dolor inducido por paclitaxel, los animales recibieron 30 minutos antes de cada inyección i.p. de paclitaxel una inyección s.c. de TTX, BD-1063, S1RA o salino. Posteriormente, se evaluaron las manifestaciones de dolor neuropático (alodinia mecánica, alodinia al frío y/o hiperalgesia al calor) inducidas por paclitaxel durante las 2-3 semanas posteriores (dependiendo del test nociceptivo) a la administración del antineoplásico. Cada animal fue evaluado solamente en un único modelo de dolor y fue tratado con un solo fármaco. Para evaluar el efecto de TTX, BD-1063, S1RA o salino en la expresión del dolor inducido por paclitaxel, se realizó una sola inyección de uno de estos fármacos el día de máximo efecto de la expresión de cada uno de los signos del dolor neuropático evaluados (ver resultados para detalles). En este caso, se evaluó al animal antes y varias veces después, durante 3 horas, de la administración de cada uno de los fármacos en estudio. Cada animal recibió una única dosis de fármaco y fue evaluado en un sólo modelo. Los animales que fueron utilizados para los estudios morfológicos con microscopía electrónica, también fueron sometidos a los test comportamentales, para cerciorarse de que habían desarrollado alodinia antes de proceder al sacrificio y obtención de las muestras para el estudio histológico. En estos experimentos, se siguió estrictamente la metodología usada para el resto de experimentos, con la única excepción de que los test comportamentales usados (test de Von Frey y test de acetona) fueron realizados en los mismos animales y que las medidas postratamiento, fueron realizadas los días 7, 10 y 28. Procedimiento para la valoración de la alodinia al frío La evaluación de la alodinia al frío fue realizada mediante el método de la acetona que describió previamente Smith et. al., (2004). El método consiste en aplicar una gota de acetona en la piel de la planta de las patas traseras, mediante una jeringa conectada a un tubo de polietileno, y evaluar la respuesta del animal. Los animales fueron alojados (30 minutos antes de la evaluación) en los compartimentos donde se iban a realizar los experimentos, para que pudieran habituarse a ellos. Los compartimentos de evaluación tenían paredes de plástico transparente con un suelo de rejilla metálica. Después de este periodo de habituación, la acetona fue aplicada tres veces de forma alternativa en cada pata trasera a intervalos de 30 segundos. En cada una de las 6 medidas, se registró el tiempo de lamido o de mordisqueo de la pata estimulada mediante un cronómetro y se representó el tiempo acumulado del lamido o mordisqueo en las seis medidas realizadas. Dado que en nuestros experimentos previos el tiempo de lamido rara vez superaba los 10 segundos, se impuso un tiempo de corte de 10 segundos en cada aplicación de acetona. Para estudiar el curso temporal de la alodinia al frío inducida por paclitaxel, se realizaron medidas previas a la administración del antineoplásico (valor pretratamiento) y en días diferentes (días 7, 10, 14, 17, 21 y 24) después de la primera inyección de paclitaxel o su vehículo. Alrededor de un 33 % de los animales tratados con paclitaxel no mostraron alodinia al frío (ver resultados), por lo que en este test comportamental se diferenció entre animales `respondedores¿ y `no respondedores¿. Los ratones `no respondedores¿ fueron fácilmente identificados debido a que su tiempo de lamido/mordisqueo de la pata estimulada era inferior a 2 segundos en los días 7 y 10 después de la administración de paclitaxel. Cuando se valoró el efecto de los fármacos en estudio, en el desarrollo de la neuropatía inducida por paclitaxel se evaluaron todos los animales; sin embargo, los animales `no respondedores¿ no fueron usados para estudiar el efecto de los fármacos en la expresión de la alodinia al frío ya que no expresaban la suficiente alodinia al frío como para identificar algún efecto antialodínico. Como en los estudios de curso temporal se observó que el paclitaxel tenía su máximo efecto alodínico entre los días 10 y 14 después de la primera inyección (ver resultados), se decidió evaluar los efectos de la TTX en la expresión de la alodinia al frío el día 14. Por tanto, en estos animales se realizó una evaluación con acetona previa al tratamiento (tres días antes) y otra el día 14 postratamiento (de paclitaxel o su vehículo). Posteriormente, se trataron con TTX o su solvente (s.c.) y se registró la respuesta a la acetona de nuevo a los 60, 120 y 180 minutos después de la inyección. Para comprobar el efecto de los antagonistas ¿1 en la expresión del dolor neuropático inducido por paclitaxel, se realizó el mismo procedimiento descrito anteriormente para TTX, pero en este caso los animales se evaluaron el día 10. Este pequeño cambio de procedimiento se hizo con el objetivo de optimizar la duración de los experimentos, ya que realmente no existían diferencias en la expresión de la alodinia al frío entre el día 10 y 14. También se estudió el efecto de la TTX y de los antagonistas ¿1 en el desarrollo de la alodinia al frío. En este caso, se realizó la evaluación pretratamiento, tres días antes de la coadministración del paclitaxel con TTX, con los antagonistas ¿1 o con salino. Los fármacos o su solvente fueron inyectados 30 minutos antes de cada una de las cinco inyecciones de paclitaxel y posteriormente se evaluó el curso temporal de la alodinia al frío inducida por paclitaxel los días 7, 10, 14, 17, 21 y 24 después de la primera inyección de paclitaxel o vehículo. Procedimiento para la valoración de la alodinia mecánica Para evaluar la alodinia mecánica, se registró el umbral de fuerza de retirada de la pata usando el aparato ¿Dynamic Plantar Aesthesiometer¿ (Ugo Basile, Italia) con ligeras modificaciones sobre el procedimiento previamente descrito (Kondo et al., 2006). El aparato electrónico de Von Frey utiliza un único filamento no flexible que es aplicado, en la planta de la pata trasera, con una fuerza que se va incrementado automáticamente (de 0 a 10 gramos, durante un periodo de 20 segundos). El reflejo de retirada hace que se corte el estímulo automáticamente y el valor de umbral mecánico es mostrado en una pantalla. El día del experimento, los ratones fueron colocados individualmente en los compartimentos de evaluación (con paredes de plástico y suelo de rejilla metálica) y se les dejó durante dos horas para que pudieran aclimatarse a ellos. Después de la habituación, cada ratón fue evaluado tres veces alternativas en cada pata trasera. Para estudiar el curso temporal de la alodinia mecánica inducida por paclitaxel, los animales fueron evaluados previamente a la administración del paclitaxel (valor pretratamiento) y en diferentes días (días 7, 10, 14 y 17) después de la primera inyección de paclitaxel o su vehículo. La mayoría de los animales (96%) tratados con paclitaxel mostraron una reducción de su umbral doloroso mecánico; los animales que no mostraron alodinia mecánica no fueron usados para examinar el efecto de los fármacos en la expresión de la alodinia mecánica inducida por el antineoplásico. Como el día 10 fue el día que se observó un cambio máximo en el umbral mecánico, se evaluó este día el efecto del tratamiento agudo con los fármacos en la expresión de la alodinia mecánica inducida por paclitaxel. Por tanto, el día 10, después del periodo de habituación al aparato, se midió el umbral mecánico y a continuación se inyectó s.c. el fármaco en estudio (TTX, antagonistas ¿1 o su solvente); posteriormente se midieron las latencias de retirada de la pata a los 30, 60, 90, 120 y 180 minutos, después de la inyección. Cuando se evaluó el efecto de los fármacos en el desarrollo de la alodinia mecánica inducida por paclitaxel, también se obtuvieron medidas pretratamiento tres días antes del tratamiento. En este caso, los fármacos o su solvente fueron inyectados s.c. 30 minutos antes de cada inyección diaria de paclitaxel o su vehículo (i.p.) durante 5 días. Las latencias postratamiento fueron evaluadas como se describió antes (días 7, 10, 14 y 17). Procedimiento para la valoración de la hiperalgesia al calor La hiperalgesia al calor fue evaluada usando el método de Hargreaves et al. (1988), ligeramente modificado. Los ratones fueron habituados en los compartimentos donde se iba a realizar la evaluación durante dos horas. Estos compartimentos individuales estaban hechos de plástico transparente y se colocaron encima de una superficie de cristal. Después del periodo de habituación, se procedió a realizar las medidas para examinar la hiperalgesia al calor usando el aparato ¿Plantar Test¿ (Ugo Basile, Italia); para ello se dirigía un foco de luz que producía calor hacia la planta de la pata trasera del animal hasta que retiraba la pata. El reflejo de retirada interrumpía la luz que se reflejaba desde la pata hasta una célula fotoeléctrica y automáticamente el aparato cortaba la luz y el contador de tiempo que se había activado al encender el foco luminoso. Por tanto, el valor de latencia para retirada de la pata (que indica el umbral doloroso al calor) era automáticamente recogido. La intensidad de la luz fue ajustada al comienzo de los experimentos para obtener un valor pretratamiento de latencia de retirada promedio de aproximadamente 8 segundos. Esta intensidad no fue cambiada a lo largo del experimento. Cada ratón fue evaluado tres veces alternativamente en cada pata y posteriormente se promediaron las seis medidas. Se impuso un tiempo de corte de 16 segundos en cada evaluación y se dejó un minuto entre cada medida en la misma pata, con el objetivo de evitar lesiones al animal. Para evaluar el curso temporal de la hiperalgesia inducida por paclitaxel, se obtuvieron latencias basales pretratamiento tres días antes del tratamiento con paclitaxel o su vehículo. Las latencias postratamiento se registraron en los días 7, 10, 14 y 17 después de la primera inyección de paclitaxel. Puesto que la máxima hiperalgesia al calor se obtuvo el día 7, consideramos este día como el más adecuado para examinar los efectos del tratamiento con TTX en la expresión de la hiperalgesia al calor inducida por paclitaxel. Por tanto, el día 7, después del periodo de evaluación, se obtuvieron latencias basales e inmediatamente después se inyectó s.c. la TTX o su solvente. Posteriormente se registraron las latencias de retirada de la pata a los 30, 60, 90, 120 y 180 minutos después de dicha inyección. Alrededor de un 9% de los animales tratados con paclitaxel no desarrollaron hiperalgesia al calor el día 7 después de la administración del paclitaxel. Estos animales no fueron usados para evaluar los efectos de la TTX en la expresión de la hiperalgesia al calor. Cuando se examinó el efecto del tratamiento con TTX en el desarrollo de la hiperalgesia al calor inducida por paclitaxel, también se obtuvieron latencias basales pretratamiento tres días antes del tratamiento con paclitaxel o su vehículo. En este caso, la TTX o su solvente fueron inyectados s.c. 30 minutos antes de cada inyección diaria de paclitaxel o su vehículo (i.p.) durante 5 días consecutivos. Las latencias postratamiento fueron evaluadas en los días 7, 10, 14 y 17 después de la primera inyección de paclitaxel. Procedimiento para la valoración de la incoordinación motora Para comprobar que los fármacos en estudio no producían alteraciones motoras que pudieran dar lugar a falsos positivos en los test de dolor, se estudió si dichos fármacos producían incoordinación motora con una aparato denominado Rotarod (Cibertec, España), como se describió previamente (Patel et al., 2001), con ligeras modificaciones. Los animales se colocaban encima de un cilindro que va incrementando su velocidad de 4 a 40 revoluciones por minuto, durante 5 minutos. Cuando el animal se cae, al no poder permanecer encima del cilindro, el tiempo de latencia de permanencia queda registrado automáticamente. Con el objetivo de acostumbrar al animal al aparato, 24 horas antes del test con los fármacos, los animales recibieron 3 sesiones de entrenamiento, separadas por 30 minutos. El día del ensayo con los fármacos, antes del tratamiento se tomaban medidas basales (tiempo 0), posteriormente se inyectaba el fármaco o su solvente y a continuación se realizaban varias medidas a lo largo del tiempo (30, 60, 90, 120 y 180 minutos después de la inyección). Se estableció un tiempo de corte de 300 segundos en cada medida. 2.3. Experimentos in vitro Ensayos de fijación de [3H](+)-pentazocina Para estudiar las características de la unión de BD-1063 y S1RA a los receptores ¿1 realizamos ensayos de fijación de radioligando, marcando los receptores ¿1 con [3H](+)-pentazocina (un radioligando selectivo del receptor ¿1). Los experimentos se realizaron en fracción sinaptosomal cruda (fracción P2) de cerebro completo de ratón, obtenida siguiendo el protocolo descrito por Entrena y cols. (2009a; b). Para estudiar la afinidad por los receptores ¿1 de cerebro de ratón de los ligandos ¿1 evaluados en los experimentos in vivo, se realizaron ensayos de competición con el radioligando. Estos ensayos fueron realizados usando los protocolos previamente descritos (Entrena et al., 2009a; b). Brevemente, las suspensiones de membranas cerebrales (en una concentración final de proteína de 0.79-1.10 mg/ml) fueron incubadas con [3H](+)-pentazocina 5 nM y con el fármaco frío (a varias concentraciones 10-10-10-5 M) o su solvente, a 30 ºC, pH 8, durante 240 minutos. Para determinar si los ligandos ¿1 tenían una interacción competitiva o no competitiva con el receptor ¿1 se usó un protocolo previamente descrito (Bowen et al., 1989; Brammer et al., 2006), con ligeras modificaciones. Así, los estudios de saturación con [3H](+)-pentazocina (0.06-33 nM) se realizaron en ausencia o en presencia de concentraciones fijas de los ligandos en estudio (12.5 nM para BD-1063 y 75 nM para S1RA). Estas concentraciones fueron seleccionadas (a partir de los datos de los estudios de competición) para obtener aproximadamente el mismo desplazamiento de [3H](+)-pentazocina. La fijación no específica fue definida como la fijación retenida en presencia de 10 ¿M de haloperidol. La reacción se detuvo con 5 ml de Tris 10 mM pH 7,4 enfriado en hielo, y el radioligando unido fue separado del libre mediante filtración con un harvester M-12 T (Brandel Instruments, SEMAT Technical Ltd., Reino Unido). Los filtrados de las muestras se realizaron a través de filtros de fibra de vidrio Whatman GF/B (SEMAT Technical Ltd., Reino Unido), previamente humedecidos con una solución de polietilenimina al 5% durante una hora. Posteriormente la radioactividad contenida en los filtros se midió en un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter España S.A.). Estudio ultraestructural con microscopía electrónica de transmisión Para evaluar la morfología ultraestructural de los nervios safenos, los animales fueron anestesiados con isofluorano y perfundidos intracardiacamente con suero salino seguido de una solución de glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 1%, en tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4 durante 15 minutos. Posteriormente se procedió a la disección de los nervios safenos derecho e izquierdo, tomando aproximadamente 4-5 mm de la parte media de los mismos, y se procedió como se expone a continuación, de acuerdo con las pautas de procesamiento establecidas previamente por Flatters y Bennett (2006), con ligeras modificaciones. La muestra de nervio safeno se mantuvo en la solución fijadora durante la noche a 4 ºC. Después de la fijación, las muestras fueron transferidas a una solución de sucrosa al 10%, en tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4 durante 24 h a 4 ºC. A continuación se realizó una posfijación en tetróxido de osmio al 1% en tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4, conteniendo ferrocianuro potásico al 1%, durante 60 minutos a 4 ºC, en oscuridad. Posteriormente, la muestra fue deshidratada en una serie graduada de alcoholes e incrustada en resina Epoxi. A continuación se realizaron cortes transversales semifinos (1 ¿m), los cuales fueron teñidos con azul de toluidina y examinados con microscopia óptica para comprobar la calidad de la muestra. Posteriormente se realizaron cortes ultrafinos (70 nm) con un ultramicrotomo y se montaron las muestras sobre rejillas para microscopia electrónica de transmisión, realizándose el contrastado de las mismas mediante citrato de plomo y acetato de uranilo. Las secciones ultrafinas fueron examinadas en un microscopio electrónico de transmisión equipado con una cámara monocroma con la que se obtuvieron las fotografías. Las medidas morfométricas se realizaron con el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html), con el que se analizaron los siguientes parámetros: área (A), perímetro (P), circularidad (4¿[A/P2], el valor 1 indica un círculo perfecto) y el diámetro de feret (la distancia más larga entre 2 puntos cualquiera a lo largo de los límites seleccionados). Para llevar a cabo el análisis ultraestructural y morfométrico se tomaron imágenes de 30 axones mielínicos de cada nervio safeno de cada ratón (15 de safeno derecho y 15 del izquierdo). Los cortes ultrafinos se estudiaron a diferentes aumentos: 4400x, 7000x y 20000x. A 4400x, se delimitó el contorno de las fibras mielínicas mediante ImageJ (Fig. A) y se midió su diámetro de feret, lo que permitió clasificarlas en fibras tipo Aß (6-12 µm) y A¿ (< 6 µm) (Fig. B) (Gardner et al., 2000). Las fibras amielínicas (fibras C) fueron identificadas a 7000x de aumento. Al igual que con las fibras mielínicas se tomaron imágenes de al menos 30 axones amielínicos de cada ratón (Fig. C). El análisis morfométrico del área, perímetro, circularidad y diámetro de feret de las mitocondrias de las fibras mielínicas (Fig. D) y amielínicas (Fig. E) fue realizado a 20000x de aumento. Para ello, se delimitó el contorno de cada una de las mitocondrias mediante ImageJ (Fig. F) y se calcularon los distintos parámetros. Sin embargo el análisis detallado de los datos se realizó exclusivamente con los valores del área, puesto que el resto de parámetros están estrechamente relacionados al área y fueron afectados por los tratamientos del mismo modo. El análisis del área mitocondrial (n=10679) de los animales controles (incluidos los ratones ¿1-KO) permite distinguir mitocondrias de tamaños muy variados y que nosotros clasificamos en 3 grupos: pequeñas (área ¿ 9 x 10-2 ¿m2), medianas (9,1-18 x 10-2 ¿m2) y grandes (>18 x 10 -2 ¿m2) (ver sección de resultados). 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 3.1. Modelo de dolor neuropático inducido por paclitaxel en ratones hembra: curso temporal de la alodinia al frío, la alodinia mecánica y la hiperalgesia al calor Los valores pretratamiento en cada test nociceptivo: test de la acetona (alodinia al frío), test de Von Frey electrónico (alodinia mecánica) y test de Hargreaves (hiperalgesia al calor) fueron similares en todos los animales. La administración durante 5 días consecutivos de paclitaxel (2 mg/kg/día) modificó las respuestas a estos tests de manera significativa (medidas postratamiento), mientras que el vehículo del paclitaxel no tuvo ningún efecto significativo. El tratamiento con paclitaxel incrementó de manera significativa el tiempo de lamido o mordisqueo de la pata en respuesta a la aplicación de acetona, de la mayoría de los animales (animales respondedores), durante las 3 semanas posteriores al tratamiento. Sin embargo, aproximadamente una tercera parte de los animales no desarrollaron alodinia al frío, es decir, su respuesta a la acetona después del tratamiento con paclitaxel fue similar a sus valores pretratamiento. El grupo tratado con el vehículo del paclitaxel tampoco desarrolló alodinia al frío. La alodinia al frío inducida por paclitaxel fue máxima 10-14 días después de la primera inyección del antineoplásico. Por tanto, estos días eran los más adecuados para evaluar el efecto de los fármacos en estudio en la expresión de la alodinia al frío inducida por paclitaxel. El tratamiento con paclitaxel también indujo alodinia mecánica en los ratones, puesto que redujo de manera estadísticamente significativa el umbral de fuerza necesario para provocar la retirada de la pata al ser estimulada con el Von Frey electrónico. Esta alodinia mecánica desapareció el día 17 y fue máxima el día 10 después de la primera inyección del antineoplásico. Por tanto el día 10 postratamiento fue considerado el día más adecuado para evaluar el efecto de los fármacos en estudio en la alodinia mecánica inducida por paclitaxel. Las inyecciones de paclitaxel también redujeron de manera significativa, la latencia de retirada de la pata tras la estimulación con un foco calorífico (test de Hargreaves). Por tanto, el paclitaxel indujo hiperalgesia al calor en los ratones que fue máxima 7 días después de la primera inyección del antineoplásico, siendo éste el día idóneo para evaluar el efecto de los fármacos en estudio en la expresión de dicha hiperalgesia al calor. 3.2. Efectos del bloqueante de canales de sodio dependientes de voltaje TTX en el dolor neuropático inducido por paclitaxel en el ratón Para comprobar el efecto de la TTX en la expresión de los signos del dolor neuropático inducido por paclitaxel, la TTX fue administrada cuando el dolor neuropático estaba plenamente desarrollado (el día de máxima expresión de cada signo). La administración s.c. de una dosis de TTX inhibió, de manera temporal, la expresión de la alodinia al frío, la alodinia mecánica y la hiperalgesia al calor, mientras que los animales inyectados con salino siguieron mostrando dolor neuropático. Por el contrario, la TTX no tuvo ningún efecto en la respuesta a los test nociceptivos de los animales controles (tratados con el vehículo del paclitaxel). La administración s.c. repetida de TTX previa a cada dosis de paclitaxel (es decir, durante la fase de inducción del dolor neuropático) previno por completo el desarrollo de la alodinia mecánica y al frío, pero no así el de la hiperalgesia al calor. Como cabría esperar, el grupo control tratado con salino antes de cada una de las 5 inyecciones del antineoplásico, si desarrolló los 3 signos del dolor neuropático evaluados. Aunque la TTX es una potente neurotoxina, con las dosis empleadas en este estudio, los animales no mostraron incoordinación motora en el test del rotarod y tampoco observamos ningún tipo de toxicidad durante los experimentos. Estos resultados sugieren que los canales de sodio sensibles a TTX juegan un papel relevante en la generación y mantenimiento del dolor neuropático inducido por paclitaxel. Nuestros resultados coinciden en gran medida con los descritos previamente por otros autores, en modelos de lesión mecánica de los nervios periféricos, donde la TTX también inhibió la expresión (Lyu et al., 2000; Marcil et al., 2006) y el desarrollo (Xie et al., 2005) del dolor neuropático. Llama la atención que la TTX inhibió la expresión de la alodinia mecánica a dosis más bajas (1-3 µg/kg) que las necesarias para inhibir la expresión de la alodinia al frío (3-6 µg/kg) o la de la hiperalgesia al calor (solo con la dosis más alta 6 µg/kg), inducidas por paclitaxel. Además la TTX solo pudo prevenir el desarrollo de ambos tipos de alodinias, mientras que fue incapaz de impedir el desarrollo de la hiperalgesia al calor. Estos efectos diferenciales de TTX podrían explicarse por la distinta participación que tienen las fibras mielínicas y/o amielínicas en la patogénesis de cada uno de estos signos de dolor. Así en la alodinia mecánica participan fundamentalmente fibras mielinizadas (sobre todo fibras Aß), mientras que en la hiperalgesia al calor intervienen principalmente fibras C amielínicas (Ossipov et al., 1997; Khan et al., 2002). En el caso de la alodinia al frio intervienen tanto las fibras mielínicas grandes Aß, como las pequeñas A¿ (Hao et al., 1996; Kim et al., 1999). Esta aparente preferencia funcional de la TTX por inhibir signos mediados por fibras mielínicas es consistente con los estudios electrofisiológicos que demuestran que la TTX aplicada directamente a un nervio periférico bloquea preferentemente la conducción de las fibras A sin afectar a las fibras C (Clarke et al., 2003). Además, las neuronas grandes y medianas de los ganglios de las raíces dorsales, que poseen fundamentalmente fibras Aß y A¿, mostraron una mayor regulación al alza de los canales y corrientes de sodio sensibles a TTX que las neuronas pequeñas de los ganglios de las raíces dorsales, que poseen fibras amielínicas C (Everill et al., 2001; Kim et al, 2001; Craner et al., 2002; Hong et al., 2004). Por tanto, la mayor eficacia de TTX para inhibir la alodinia al frío y mecánica parece indicar una mayor contribución de los canales de sodio dependientes de voltaje sensibles a TTX en la patogénesis de estos signos del dolor neuropático. 3.3. Efectos del bloqueo o ausencia de los receptores ¿1 en el dolor neuropático inducido por paclitaxel en el ratón Los ensayos de fijación con el radioligando selectivo para el receptor ¿1, [3H](+)-pentazocina, ponen de manifiesto que tanto el antagonista ¿1 prototipo (BD-1063), como el nuevo antagonista ¿1 (S1RA), tienen una gran afinidad por el receptor ¿1 (valores de Ki de 4.43 y 29.99 nM, respectivamente) e interaccionan con él competitivamente. En este bloque experimental no se hicieron experimentos para evaluar el papel del receptor ¿1 en la hiperalgesia al calor inducida por paclitaxel, puesto que datos experimentales nuestros y los descritos previamente por otros autores, indicaban que el bloqueo con un antagonista ¿1 (Roh et al., 2008) o la ausencia (De la Puente et al., 2009) del receptor ¿1 no inhibía dicha hiperalgesia al calor. Los antagonistas ¿1 fueron administrados s.c. cuando los signos del dolor neuropático eran máximos para comprobar el efecto del bloqueo del receptor ¿1 en la expresión del dolor neuropático inducido por paclitaxel. La administración aguda de BD-1063 y de S1RA redujo la duración del tiempo de lamido/mordisqueo de la pata inducido por la acetona, y aumentó el umbral de fuerza necesario para provocar una respuesta de retirada de la pata estimulada con el filamento de Von Frey, siendo ambos efectos dosis-dependientes. Sin embargo, el grupo tratado con salino siguió mostrando alodinia, durante las 3 horas de evaluación. Por el contrario, ni el BD-1063 ni el S1RA tuvieron ningún efecto en la respuesta a la acetona ni al filamento de Von Frey en los animales controles, tratados con el vehículo del paclitaxel. Para estudiar el efecto del antagonismo farmacológico del receptor ¿1 en el desarrollo de la alodinia al frío y mecánica inducida por paclitaxel, el BD-1063 y el S1RA, así como su solvente (salino), fueron administrados s.c. antes de cada una de las inyecciones de paclitaxel. Ambos antagonistas ¿1, pero no su solvente, bloquearon por completo tanto el desarrollo de la alodinia al frío como el de la alodinia mecánica. Por último, ni el BD-1063 ni el S1RA, a dosis que inhiben la expresión de la alodinia, produjeron efectos de incoordinación motora. Estos resultados ponen de manifiesto que el bloqueo del receptor ¿1 impide tanto la expresión como el desarrollo de la alodinia al frío y la alodinia mecánica inducidas por paclitaxel y, por tanto, que el receptor ¿1 debe estar activado para que se desarrolle este tipo de dolor neuropático. En consecuencia, los antagonistas del receptor ¿1 podrían tener interés terapéutico para contrarrestar el dolor inducido por paclitaxel, siendo especialmente interesante el efecto profiláctico. Ello es así puesto que (a diferencia de las neuropatías inducidas por lesiones mecánicas o enfermedades metabólicas) en las neuropatías inducidas por fármacos neurotóxicos, se conoce perfectamente cuando empieza el riesgo de la lesión neurotóxica, por lo que sería posible aplicar un tratamiento preventivo. También empleamos una herramienta no farmacológica, como son los animales ¿1-KO, para comprobar que efecto tiene la completa ausencia del receptor ¿1 en el dolor neuropático inducido por paclitaxel, comparando el curso temporal del dolor neuropático de estos animales con el de los animales salvajes. En primer lugar, comprobamos que los animales ¿1-KO tenían una respuesta basal a la aplicación de acetona y al filamento de Von Frey, prácticamente idéntica a la de los animales salvajes. Igualmente, los ratones ¿1-KO tampoco tuvieron ninguna deficiencia en la coordinación motora en el test del rotarod. Sin embargo, cuando se compararon los cursos temporales de la alodinia al frío y mecánica de los ratones salvajes y ¿1-KO, fue posible comprobar que mientras que los animales salvajes desarrollaban ambos tipos de alodinia, los animales desprovistos del receptor ¿1 mantuvieron unos valores y umbrales de respuesta prácticamente iguales que antes del tratamiento con el antineoplásico, es decir, no desarrollaron dolor neuropático. Como era de esperar el vehículo del paclitaxel no tuvo ningún efecto en ningún tipo de animal. Por consiguiente, estos datos ponen de manifiesto que el receptor ¿1 tiene que estar presente para que se desarrolle el dolor neuropático inducido por paclitaxel, confirmando el papel relevante de dicho receptor en esta neuropatía. Estos datos coinciden en general con investigaciones previas, en modelos de neuropatía por lesión mecánica de nervio periférico, en las cuales animales salvajes tratados preventivamente con un antagonista ¿1 (Roh et al., 2008) y animales ¿1-KO (De la Puente et al., 2009) tampoco desarrollan dolor neuropático, y podrían explicarse por el hecho de que los receptores ¿1 parecen ser necesarios para el proceso de sensibilización central (Drews and Zimmer, 2009). En el proceso de sensibilización central que ocurre en el dolor neuropático se produce un incremento en la función de las neuronas que forman las vías del dolor, provocado por un aumento en la excitabilidad y eficacia sináptica, así como una reducción de su inhibición (Latremoliere and Woolf, 2009). La neuropatía inducida por paclitaxel ha sido asociada con alteraciones electrofisiológicas de los nervios periféricos y médula espinal (Cata et al., 2006; Xiao and Bennett, 2008) que son características de dicho proceso. Además, también se ha descrito que el paclitaxel produce una regulación a la baja de los transportadores de glutamato en la médula espinal de ratas neuropáticas (Weng et al., 2005; Cata et al., 2006), que podría producir una estimulación excesiva y prolongada de los receptores de NMDA, y sus rutas moleculares asociadas (como la fosforilación de la ERK), que podría desencadenar sensibilización central que generaría y mantendría el estado de dolor neuropático (Ji et al., 2009; Chen et al., 2010). Es interesante resaltar, que algunas de las anomalías electrofisiológicas típicas del proceso de sensibilización central están significativamente reducidas en los animales ¿1-KO con respecto a animales salvajes (De la Puente et al., 2009). También se ha descrito que la fosforilación de ERK, que se produce tras la lesión del nervio ciático, no ocurre en animales ¿1-KO (De la Puente et al., 2009), y que la regulación al alza de la subunidad NR1 del receptor NMDA y de su forma fosforilada (pNR1), asociada al dolor neuropático inducido por lesión mecánica del nervio periférico fue prevenida por un antagonista ¿1 (Roh et al., 2008). Por tanto, nuestros datos podrían ser explicados por una posible inhibición, debida al bloqueo farmacológico o a la ausencia del receptor ¿1, de los procesos electrofisiológicos y bioquímicos relacionados con la sensibilización central inducidos por paclitaxel. 3.4. Efectos del bloqueo o la ausencia de los receptores ¿1 en las anomalías mitocondriales en el nervio safeno asociadas al dolor neuropático inducido por paclitaxel Para comprobar si el modelo experimental de dolor neuropático inducido por paclitaxel descrito en esta Tesis Doctoral, estaba relacionado con anomalías mitocondriales similares a las descritas por otros autores (Flatters and Bennett, 2006; Jin et al., 2008), se recogieron muestras de nervio safeno en 3 puntos clave del curso temporal del dolor neuropático: antes del tratamiento (día pretratamiento), el día de máxima expresión del dolor (día 10 postratamiento) y un día en el que el dolor ya no se manifestaba (día 28 postratamiento). Antes de sacrificar al animal para la obtención de los nervios safenos, todos los animales fueron sometidos a los tests comportamentales. En este caso se realizó tanto el test de la acetona como el de Von Frey electrónico en el mismo animal, con el objetivo de utilizar el menor número de animales posible y para estar seguros de que el mismo animal manifestaba ambas alodinias. Para llevar a cabo el objetivo principal de este bloque experimental (comprobar si el bloqueo o la ausencia de los receptores ¿1 impedía la aparición de las anomalías mitocondriales), también se realizó el mismo procedimiento experimental en animales ¿1-KO, y se llevó a cabo un tratamiento preventivo con el antagonista selectivo ¿1 BD-1063, 30 minutos antes de cada dosis de paclitaxel. En primer lugar, se comprobó que el paclitaxel, pero no su vehículo, produjo alodinia mecánica y al frío en los animales salvajes y que los animales ¿1-KO y los animales salvajes tratados preventivamente con BD-1063, no desarrollaron dolor neuropático inducido por el antineoplásico. Al analizar las imágenes de microscopía electrónica de transmisión del nervio safeno de animales salvajes y ¿1-KO controles (sin tratamiento), se puso de manifiesto que no existían diferencias significativas en las características ultraestructurales tanto de las fibras mielínicas como amielínicas. Las mitocondrias tenían una estructura oval o circular envuelta por una doble membrana lipídica y en su interior se apreciaban las crestas y el material denso amorfo típicos. El análisis morfométrico del área mitocondrial mostró un amplio rango de valores (desde 2 hasta más de 60 x 10-2 ¿m2) y al realizar un análisis detallado de su distribución, fue posible distinguir 3 grupos diferentes: mitocondrias pequeñas (área ¿ 9 x 10-2 ¿m2), medianas (9.1-18 x 10-2 ¿m2) y grandes (> 18 x 10 -2 ¿m2), en todas las fibras de los nervios safenos de animales controles salvajes y ¿1-KO. Cuando se analizaron las mitocondrias según el tipo de fibra se observó que en las fibras mielínicas Aß y A¿, la mayoría de las mitocondrias eran pequeñas y medianas. En las fibras C amielínicas ocurría lo mismo, sin embargo, el porcentaje de mitocondrias grandes era significativamente más alto (5-6 veces más) que el de las fibras mielínicas, tanto en animales salvajes como en ¿1-KO. Todas las mitocondrias incluidas en el grupo de ¿mitocondrias grandes¿ (>18 x 10 -2 ¿m2) tenían la doble membrana y se caracterizaban por un hinchamiento pronunciado y/o vacuolización, lo que implicaba un agrandamiento de 2-6 veces del área media mitocondrial y un diámetro superior a 480 nm. Con estos criterios, similares (e incluso más restrictivos) a los usados previamente por otros autores (Flatters and Bennett, 2006; Jin et al., 2008), se consideraron a estas mitocondrias como ¿mitocondrias atípicas¿. Tras el estudio con microscopía electrónica de transmisión de los nervios safenos de ratones salvajes y knockout ¿1 a los 10 días del inicio del tratamiento con paclitaxel, no se observaron en ninguno de los grupos alteraciones significativas de las células de Schwann o fenómenos de degeneración mielínica, ni agregados neurotubulares. Sin embargo, el tratamiento con paclitaxel indujo en los animales salvajes un incremento significativo (6.4 veces, con respecto a los animales salvajes sin tratamiento) en el porcentaje de mitocondrias atípicas de la fibras Aß; mientras que en los animales ¿1-KO se produjo un incremento bastante menor (1.8 veces, con respecto a los animales ¿1-KO sin tratamiento), que no llegó a ser significativo. En las fibras A¿ el tratamiento con paclitaxel también produjo un incremento del porcentaje de mitocondrias atípicas (que no llegó a ser significativo) en los animales salvajes (3.8 veces), pero no modificó dicho porcentaje en los animales ¿1-KO (1.33 veces). En las fibras amielínicas el paclitaxel no produjo ningún cambio significativo en el porcentaje de mitocondrias atípicas, en ambos tipos de ratones. También se comprobó que a los 10 días de tratamiento, el vehículo del paclitaxel no produjo ningún cambio estadísticamente significativo en ninguno de los 3 tipos de fibras. Por el contrario, cuando se analizaron las imágenes tomadas de nervios safenos, obtenidos 28 días después del tratamiento con paclitaxel o su vehículo, se puso de manifiesto que no existían diferencias significativas en el porcentaje de mitocondrias atípicas, ni en las fibras mielínicas ni en las amielínicas, de ratones salvajes y ¿1-KO. El tratamiento preventivo con el antagonista del receptor ¿1 BD-1063, a una dosis que previene el dolor neuropático inducido por paclitaxel, previno por completo el incremento en el porcentaje de mitocondrias atípicas que provoca el paclitaxel en las fibras mielínicas de ratones salvajes. El hecho de que el curso temporal de las atipias mitocondriales coincida con el curso temporal del dolor neuropático inducido por paclitaxel, y que cuando se bloquea la aparición del dolor (mediante BD-1063 o en ratones ¿1-KO) también se reduzcan considerablemente las atipias mitocondriales, hace pensar que ambos fenómenos estén relacionados. Hasta hace poco se desconocía si estas mitocondrias atípicas tenían alguna consecuencia funcional, sin embargo, recientemente, se ha descrito que las mitocondrias de los nervios ciáticos de animales con dolor neuropático inducido por paclitaxel y por oxaliplatino (otro antineoplásico) tienen reducida la respiración mitocondrial y su producción de ATP, y por tanto deben estar funcionalmente dañadas (Zheng et al., 2011). El mecanismo mitotóxico por el cual el paclitaxel produce este fenómeno no está del todo claro. Se ha descrito que la tubulina (proteína a la que se une el paclitaxel) se encuentra asociada a una proteína mitocondrial, el canal aniónico dependiente de voltaje (en inglés VDAC) (Carre et al., 2002), que es la proteína más abundante de la membrana externa mitocondrial y que controla el flujo de ciertos metabolitos e iones, como el Ca2+ (Tan y Colombini, 2007). Se ha sugerido que los fármacos que se unen a los microtúbulos (como el paclitaxel) podrían modular la interacción de la ß-tubulina con VDAC y por tanto modificar la permeabilidad de la mitocondria (Rostovtseva y Bezrukov, 2008). De hecho VDAC podría regular al poro de transición de permeabilidad mitocondrial (en inglés mPTP), que es un poro no específico que se abre en la membrana externa mitocondrial, bajo ciertas condiciones como un exceso del Ca2+ almacenado en la mitocondria, y que permitiría la entrada de moléculas de diámetro menor de 1.5 kDa. La apertura de mPTP provocaría el hinchamiento y vacuolización mitocondrial, pero también la liberación del Ca2+ mitocondrial (revisado por Halestrap, 2009). En base a ésto, se ha propuesto que el paclitaxel se uniría a VDAC, lo que aumentaría la permeabilidad mitocondrial (apertura de mPTP), que provocaría el hinchamiento y vacuolización mitocondrial, y la salida del Ca2+ almacenado en la mitocondria. Esta salida de Ca2+ llevaría a un aumento del Ca2+ intracelular que podría provocar hiperexcitabilidad neuronal, lo que explicaría la hipersensibilidad que induce el paclitaxel (Flatters and Bennett, 2006; Jin et al., 2008). Apoyando esta teoría, ha sido descrito por varios autores que ciertos agentes que reducen el Ca2+ intracelular inhiben y/o previenen el dolor neuropático inducido por paclitaxel (Flatters y Bennett, 2004; Matsumoto et al., 2006; Siau y Bennett, 2006; Xiao et al., 2007; Xiao et al., 2008; Gauchan et al., 2009; Okubo et al., 2011). Se ha descrito que el receptor ¿1 es una chaperona regulada por ligando que se encuentra normalmente en la membrana del retículo endoplasmático (en una región asociada funcionalmente a la mitocondria) y que participa en la modulación de la homeostasis del Ca2+ (Su et al., 2010). En concreto, el receptor ¿1 interviene en el plegamiento del receptor de inositol trifosfato (IP3), incrementando la entrada de Ca2+ en la mitocondria (Hayashi and Su, 2007). Quizás, la ausencia o el bloqueo del receptor ¿1 pueda prevenir el exceso de Ca2+ mitocondrial responsable de la apertura de mPTP y por tanto, de esta forma, prevenir el aumento de mitocondrias atípicas. Se ha propuesto que el efecto global que conlleva la activación de los receptores ¿1 es un incremento del Ca2+ citosólico, debido a la potenciación de la entrada de Ca2+ a la célula a través del receptor de NMDA en la membrana plasmática, y a la liberación de Ca2+ inducido por IP3 desde las reservas del retículo endoplasmático (De la Puente et al., 2009). Por tanto, la ausencia o bloqueo de los receptores ¿1 podría compensar el aumento del Ca2+ citosólico derivado de la apertura del mPTP, inducida por paclitaxel, impidiendo que la concentración de Ca2+ citosólico alcance el umbral necesario para desencadenar el proceso de sensibilización central y por tanto, el dolor neuropático. 4. CONCLUSIONES 4.1. Conclusiones específicas 1. La administración repetida de paclitaxel indujo dolor neuropático en ratones hembra, que se caracterizó por alodinia al frío y mecánica, e hiperalgesia al calor. 2. La administración sistémica del bloqueante de canales de sodio TTX, inhibió la expresión de la alodinia mecánica, la alodinia al frío y la hiperalgesia al calor inducidas por paclitaxel. En cambio cuando la TTX se administró como tratamiento profiláctico, solo previno el desarrollo de ambos tipos de alodinias. 3. Los antagonistas selectivos del receptor ¿1, BD-1063 y S1RA (administrados s.c.), inhibieron la expresión de la alodinia mecánica y al frío inducidas por paclitaxel. 4. El antagonismo farmacológico (con BD-1063 o S1RA) o la inactivación genética de los receptores ¿1 bloqueó por completo el desarrollo de la alodinia mecánica y al frío inducidas por paclitaxel. 5. El dolor neuropático inducido por paclitaxel está asociado con un aumento en el porcentaje de mitocondrias atípicas en las fibras mielínicas del nervio safeno. En paralelo con la prevención del dolor, la inactivación genética o el antagonismo farmacológico de los receptores ¿1 también previno el incremento de atipias mitocondriales producido por el antineoplásico. 4.2. Conclusiones generales 1. La administración repetida de paclitaxel a ratones imita algunos de los signos del dolor neuropático inducido por paclitaxel en humanos y representa un modelo adecuado para explorar dianas terapéuticas potenciales para combatir el dolor neuropático derivado de su administración. 2. Los canales de sodio dependientes de voltaje y los receptores ¿1 juegan un papel importante en el desarrollo y la expresión del dolor neuropático inducido por paclitaxel. Por tanto, el bloqueo de estas dianas podría constituir una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de la neuropatía inducida por paclitaxel.