Modulación mutacional de proteínasestudios acerca de cooperatividad, puentes disulfuro diseñados, proteínas ancestrales resucitadas y catálisis enzimática mediante técnicas de molécula individual

Resumen

Resumen tesis Inmaculada Sánchez Romero El termino ¿ingeniería de proteínas¿ normalmente hace referencia al diseño y preparación de proteínas con propiedades alteradas (¿mejoradas¿) o innovadoras. La ingeniería de proteínas es de gran interés biotecnológico y biomédico debido a su implicación en las aplicaciones practicas de las proteínas. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos generales para la ingeniería de proteínas con el propósito de modular propiedades relevantes en proteínas como su actividad enzimática o actividad. En esta tesis se han empleado tres estrategias diferentes para alcanzar este objetivo: resurrección de proteínas ancestrales, modulación de la cooperatividad en el plegamiento e ingeniería de puentes disulfuro. 1. Reconstrucción de proteínas ancestrales. La reconstrucción y resurrección de proteínas ancestrales posee importantes aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. En este contexto, la palabra ¿reconstrucción¿ hace referencia a los cálculos bioinformáticos que conducen a aproximaciones plausibles de las secuencias de proteínas pertenecientes a organismos extintos; y con ¿resurrección¿ nos referimos a la preparación experimental (y la caracterización experimental subsecuente) de las proteínas especificadas por dichas secuencias. La relevancia de este resultado puede reconocerse fácilmente considerando que la ingeniería de proteínas normalmente implica modificaciones en la secuencia de aminoácidos que ocasionan cambios en las propiedades de las proteínas. En el primer bloque de esta tesis se engloban tres trabajos en los que, mediante la resurrección de proteínas ancestrales y Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) de molécula individual, hemos estudiado la evolución química de la catálisis enzimática de tiorredoxina. Estos trabajos se enmarcan dentro de la colaboración entre los grupos de investigación del Dr. Eric A. Gaucher (Georgia Institute of Technology, Atlanta), el del Dr. Julio M. Fernández (Universidad de Columbia, Nueva York) y el del Dr. José Manuel Sánchez-Ruiz (Universidad de Granada). Mediante AFM, en concreto, en su variante de force clamp, hemos estudiado la catálisis enzimática de las tiorredoxinas. En primer lugar, para determinar la evolución de la catálisis enzimática realizamos el estudio de la actividad enzimática de tiorredoxinas pertenecientes a cuatro reinos de la vida, con origen eucariota y bacteriano. Estos experimentos y sus resultados constituyen el primer capítulo de este bloque temático. Posteriormente, se quiso establecer en qué momento de la evolución apareció la divergencia catalítica de tiorredoxina. Para ello, se empleó la reconstrucción ancestral. Se reconstruyó el árbol filogenético de tiorredoxina y, para ciertos nodos relevantes, se obtuvo la secuencia ancestral de las proteínas correspondientes. Hemos estudiado la estabilidad térmica mediante Calorimetría Diferencia de Barrido (DSC) y la actividad enzimática mediante AFM de estas proteínas ancestrales ¿resucitadas¿. Los resultados obtenidos se presentan en el segundo capítulo de este primer bloque temático. La divergencia en el mecanismo catalítico de las tiorredoxinas surgió como resultado de su evolución. Las propiedades de las proteínas pueden verse modificadas durante su evolución por diversas razones: como respuesta a modificaciones en el entorno que rodea al organismo, como resultado de que las proteínas asuman nuevos roles o por la necesidad de hacer frente a la evolución de los sustratos con los que interaccionan molecularmente. En algunos trabajos recientes se ha expuesto la idea de que las mutaciones que aumentan la actividad implican una disminución en la estabilidad, por lo que la evolución estaría limitada por los efectos desestabilizantes de las mutaciones. Este argumento se pone en duda en el tercer y último capítulo de este bloque. En este trabajo se propone un mecanismo para la adaptación basado en un conjunto de mutaciones conservativas que permite la optimización simultanea e independiente de distintas propiedades de la proteína. A partir de alineamientos de secuencias de tiorredoxinas se ha construido una biblioteca combinatorial. Para determinadas variantes de dicha biblioteca hemos estudiado la catálisis enzimática mediante AFM y la estabilidad mediante DSC. 2. Modulación de la cooperatividad en el plegamiento. Uno de los avances más importantes de los últimos años en nuestro conocimiento fundamental acerca de las proteínas es el establecimiento experimental de que su plegamiento pueda ocurrir sin necesidad de atravesar barreras energéticas, lo que suele denominarse plegamiento sin-barreras (barrierless folding) o plegamiento colina abajo (downhill folding). Si no existe barrera (o esta es lo suficientemente pequeña) todos los estados a lo largo de la ruta de plegamiento serían observables directamente y podría obtenerse experimentalmente una descripción molecular detallada del proceso de plegamiento. Los estudios sobre plegamiento downhill sugieren que las barreras de plegamiento en proteínas están sujetas a selección natural, es decir, la existencia de una barrera no es una imposición de la física de las proteínas, sino que muchas proteínas han sido ¿seleccionadas¿ para tener una barrera significativa, al objeto de proteger el estado nativo frente a procesos de alteración indeseables que ocurren preferentemente a partir de estados desplegados o parcialmente desplegados. El argumento evolutivo expuesto tiene, sin embargo, otro lado. En general, una barrera marginal permite que numerosos estados conformacionales de la proteína sean fácilmente accesibles. Por lo tanto, una barrera marginal (o no existente) puede haber sido seleccionada naturalmente en algunas proteínas, si esta diversidad conformacional es necesaria para su función. Un ejemplo de posible papel biológico de proteínas con barreras de plegamiento marginales lo constituye la ¿-lactalbúmina. El análisis de los datos de desnaturalización de esta proteína indican la existencia de una barrera marginal. La implicación más importante de estos estudios sobre lactalbúmina están relacionados con el hecho de que se ha demostrado que algunas variantes de ¿-lactalbúmina (el llamado confórmero HAMLET: ¿Human Alpha-lactalbumin Made Letal to Tumor cells¿) inducen selectivamente apoptosis en células tumorales. Por lo tanto, el diseño de proteínas con barreras marginales (o inexistentes) puede tener numerosas aplicaciones biomédicas, ya que estas proteínas pueden acceder fácilmente a diferentes estados conformacionales, lo que facilita su interacción con diferentes componentes celulares y hace que presenten efectos biológicos de potencial interés terapéutico. El objetivo de este trabajo, que constituye el segundo bloque temático de la presente tesis, es el obtener proteínas modificadas con barreras de plegamiento marginales. Como proteína modelo hemos tomado la tiorredoxina de E. coli. Para modular la barrera de plegamiento hemos modificado las interacciones no locales de esta proteína. Se ha encontrado una fuerte correlación entre la magnitud de la barrera de plegamiento y el tamaño y la topología de la proteína. Un parámetro relacionado con la topología es el orden de contacto, que determina la distancia media entre los residuos de la cadena que interaccionan. Estudios de David Baker y colaboradores han sugerido que la velocidad de plegamiento de la proteína correlaciona con el orden de contacto, de manera que proteínas con un valor alto de este parámetro (con un gran número de contactos no locales) tendrían un plegamiento lento. En este trabajo, hemos seleccionado residuos con un número elevado de contactos no locales y los hemos sustituido por otros de menor tamaño. Para determinar el valor de la barrera de energía libre de cada variante, hemos empleado distintos modelos físicos en el análisis de los datos de DSC: modelo de barrera variable basado en la teoría de Landau de transiciones críticas, modelo de superficie monodimensional de energía libre de campo medio y modelos tipo Ising que usan la estructura nativa como patrón. 3. Ingeniería de puentes disulfuro. En el tercer y ultimo bloque, se presenta un estudio en el que se ha empleado la fitasa de C. braakii para probar el efecto de puentes disulfuro de ingeniería en la estabilidad cinética. Esta enzima es de gran interés biotecnológico, ya que es capaz de aumentar la biodisponibilidad del fósforo, razón por la que se añade a los piensos animales. Este trabajo se ha realizado en colaboración con la empresa danesa Novozymes. Los puentes disulfuro pueden afectar a la estabilidad termodinámica y a la estabilidad cinética de la proteína. En el caso de la estabilidad termodinámica, estos crosslinks incrementan la estabilidad del estado nativo reduciendo la entropía configuracional de la cadena polipeptídica en el estado desnaturalizado; pero no todos los puentes disulfuro diseñados tienen un efecto positivo sobre la estabilidad de la proteína. La mutación de residuos a cisteínas puede romper o eliminar interacciones que estabilizan la estructura nativa, además, la inserción de un puente disulfuro atípico puede introducir tensión a la estructura de la proteína, pudiendo contrarrestar el efecto estabilizante del crosslink. Para evitar la introducción de tensiones, los puentes disulfuro se suelen diseñar en zonas flexibles de la proteína, ayudando así a minimizar cualquier perturbación causada por los reemplazamientos a cisteína. En una aplicación biotecnológica, la velocidad de inactivación irreversible de la proteína puede tener mayor relevancia que el cambio en energía libre de desplegamiento. Los puentes disulfuro pueden tener un importante efecto sobre la estabilidad cinética de la proteína. La estabilidad cinética viene determinada por una barrera de energía libre de activación, esto es, la diferencia en energía libre entre el estado nativo y el estado de transición. Dicha barrera podría garantizar que la función biológica de la proteína se mantenga, al menos, durante una escala de tiempo fisiológicamente relevante, incluso si el estado nativo no es termodinámicamente estable con respecto a las formas no funcionales. En este trabajo, hemos estudiado, para la fitasa wild type y para distintas variantes mutantes, la estabilidad termodinámica mediante experimentos de DSC, y la estabilidad cinética mediante experimentos de inactivación térmica. de molécula individual.