Discriminación varietal del polen de olivo (olea europaea l.) mediante características morfológicas y marcadores microsatélites

Resumen

El olivo (Olea europaea L.) posee una gran diversidad genética, con un número estimado de variedades cultivadas en el mundo superior a 1200. La exploración de esta diversidad despierta un creciente interés en campos como la agronomía, la mejora genética, la industria agroalimentaria y el conocimiento del genoma de la especie. La identificación de las variedades de olivo se ha basado tradicionalmente en esquemas pomológicos que emplean marcadores agronómicos y morfológicos. A estas aproximaciones se ha unido recientemente el desarrollo de marcadores moleculares, entre los que destacan los marcadores microsatélites (SSRs). La mayor parte de los métodos de discriminación han sido optimizados en materiales vegetativos diploides, especialmente en hojas. Sin embargo, el polen, que constituye el gametofito masculino de las plantas espermatofitas, apenas ha sido utilizado para la clasificación de las variedades. La identificación varietal del polen tiene potencialmente numerosas aplicaciones agronómicas, biotecnológicas, médicas, evolutivas y agroalimentarias. En el presente trabajo se aborda el desarrollo y evaluación de distintos métodos de clasificación varietal a partir de polen de olivo. Por una parte, se han utilizado distintos métodos de microscopía y de análisis morfométrico de las imágenes obtenidas para determinar la variabilidad de los caracteres más comúnmente utilizados como descriptores palinológicos: área del grano, su eje polar, su diámetro ecuatorial, el grosor de ectexina, capa basal, endexina, intina, altura de las columelas, distancias entre columelas, altura del muro, anchura del muro, área de los lúmenes y distancias entre elementos esculturales, así como la correlación entre estos parámetros y el origen varietal de las muestras. Los resultados obtenidos han demostrado el potencial considerable de este método, que constituye una herramienta adicional esencialmente utilizable en combinación con otros tipos de marcadores. Asimismo, se ha evaluado de forma preliminar la utilización de la autofluorescencia emitida por la exina en microscopía confocal también como método discriminatorio adicional no disruptivo y de fácil utilización, al no precisar de métodos de preparación de las muestras. Por otra parte, se han optimizado los protocolos para la extracción de ADN de calidad a partir del polen, y para la posterior amplificación de SSRs, demostrándose la eficacia de un panel de 10 marcadores en la identificación de 26 cultivares de olivo. La comparación de los perfiles alélicos obtenidos a partir de muestras suficientemente representativas de polen con aquellos obtenidos a partir de ADN de hojas de los mismos individuos muestra una prácticamente total identidad. Sobre estas premisas, y con objeto de permitir el desarrollo de futuras aplicaciones de la discriminación varietal del polen, ha sido generada una amplia base de datos de perfiles alélicos en variedades de olivo. Esta base cuenta con perfiles obtenidos de 183 individuos bien caracterizados varietalmente, procedentes de colecciones públicas y privadas de diversos orígenes geográficos que incluyen España, Portugal, Italia, Grecia, Túnez etc. El análisis detallado de esta base de datos confirma la gran diversidad genética presente en esta especie, permitiendo la identificación de 90 genotipos diferentes, así como un número considerable de confusiones en la identificación de variedades. También han sido establecidas las relaciones genéticas entre los genotipos identificados y han sido detectadas tendencias de agrupación entre los individuos analizados. La comparación entre las anteriores clasificaciones basadas respectivamente en el uso de parámetros morfológicos del polen y en marcadores SSR indica que los resultados obtenidos en ambos casos son consistentes, comparables y en muchos casos complementarios. Finalmente, en una de las aplicaciones prácticas del método SSR en polen se ha podido identificar con certeza el origen varietal de 8 muestras ciegas de polen comercial suministrado por una empresa especializada en la fabricación de vacunas alergénicas desensibilizantes. Sin embargo, se ha revelado que el método desarrollado es de momento incapaz de identificar el origen varietal de las citadas vacunas, dado que incluyen únicamente trazas de ADN procedente del polen usado para preparar los extractos. Son esperables futuros desarrollos de la técnica, así como numerosas aplicaciones tanto en el olivo como en otras especies, que son ampliamente discutidas.