Mecanismos de comunicación intercelular en pseudomonas putida kt2440

Resum

Desde hace relativamente poco, las bacterias, más que seres unicelulares, son consideradas como organismos sociales capaces de desarrollar una serie de actuaciones de forma colectiva y coordinada apoyándose en una comunicación química a la que se ha denominado 'quórum sensing' (QS). Se trata de un sofisticado sistema de comunicación célula a célula, empleado por las bacterias para monitorizar su densidad poblacional y en función de ello promover cambios en la expresión génica que les permitirá una mejor adaptación al medio. QS esta mediado por la acción de pequeñas moléculas señalizadoras denominadas autoinductoras que ellas mismas producen. Estas señales difunden al medio y son percibidas por otras células en proximidad o por la misma célula productora, de manera que, una vez alcanzada una concentración umbral critica de dicha señal, se activan o reprimen ciertos genes diana de QS. Los cambios en el metabolismo y en el comportamiento que se suceden de forma sincronizada permite una coordinación funcional de la población bacteriana que va a ser favorable únicamente cuando estas se encuentran en gran abundancia (p. ej producción de bioluminiscencia, antibióticos, virulencia, formación de biofilms, etc.) Los componentes clave de cualquier modulo de QS son la sintetasa de la señal, el receptor de la señal y la propia molécula señal. Muchas bacterias emplean múltiples moléculas señalizadoras reguladas por diferentes módulos de QS, que a su vez interaccionan entre si. Estos sistemas de QS están frecuentemente sometidos a una retroalimentación positiva o autoinducción que a altas densidades de la población bacteriana resulta en un marcado incremento en la síntesis del autoinductor y por consiguiente en un refuerzo de la expresión de los genes diana. Actualmente existe una gran variedad de autoinductores que se caracterizan por su gran diversidad química. La lista va en aumento e incluye: Acil-homoserina lactonas (AHL), peptidos autoinductores (AIP), furanosil diesters (también llamado autoinductor-2, AI-2), gamma-butirolactonas (GBL), quinolonas (PQS, pseudomonas quinolone signal), y factores difusibles de señalización (DSF). Entre la multitud de procesos multicelulares regulados por QS, se ha descrito su implicación en aquellos importantes que tienen lugar en la asociación planta-bacteria, por ejemplo la formación de biofilms, producción de sideróforos y antibióticos, inducción de resistencia sistémica en plantas, etc. Así, se ha visto como este fenómeno opera en las interacciones, ya sean beneficiosas o patogénicas que ocurren entre la bacteria y superficies de plantas, así como en aquellas entre los microorganismos que coexisten en la comunidad asociada a la superficie vegetal. En contraste, se han encontrado elementos que interfieren con estos sistemas de QS, como son compuestos liberados por la planta que antagonizan o imitan las señales de QS, y enzimas degradadoras de moléculas señal excretadas por algunas bacterias. El grupo de investigación en el que esta tesis ha sido desarrollada esta interesado en las relaciones que tienen lugar en poblaciones de bacterias asociadas a superficies vegetales, en concreto a nivel de la rizosfera (superficie de la raíz y región de suelo bajo su influencia). Como organismo modelo para el estudio de dichas relaciones se empleo Pseudomonas putida KT2440, una especie caracterizada por su versátil potencial catabólico y gran capacidad para colonizar la raíz de algunas plantas de interés agronómico, estableciendo con ellas una asociación mutualista beneficiosa. Trabajos previos identificaron un gen de Pseudomonas putida KT2440 que juega un papel importante en la colonización de semillas y raíces, denominado ddcA. Este gen posee un patrón de expresión dependiente de densidad celular, lo cual constituía la primera evidencia de la existencia de un fenómeno de quorum sensing en esta cepa. Sin embargo, una búsqueda en el genoma secuenciado de esta cepa, reveló que carecía de los determinantes genéticos para la síntesis de las señales actualmente conocidas de quorum sensing, ya que no existe ningún gen homólogo de las familias de las sintetasas de autoinductores conocidas. En el análisis genético, se encontró un gen que codifica una proteína de la familia LuxR, responsable de la recepción de moléculas señal y la activación de la expresión génica en muchos microorganismos, al que se denominó PpoR. Todo lo anterior apunta a que KT2440 posee un mecanismo de comunicación intercelular de tipo quórum sensing propio, no descrito hasta la fecha, y que a su vez, podría reconocer y sensar a otras bacterias vecinas estableciendo los llamados mecanismos de 'cross-talking'. Esta tesis contempla como objetivos la caracterización de los posibles procesos de señalización intercelular de tipo quorum sensing en Pseudomonas putida KT2440, el análisis del papel de señales producidas por otros microorganismos con los que esta cepa comparte nicho, así como su implicación en la interacción bacteria-planta. En el capitulo 1 se llevo a cabo la caracterización de un sistema de dos componentes formado por un sensor histidin kinasa y un regulador de respuesta, al que denominamos RoxS/RoxR y que fue identificado por afectar la expresión del gen ddcA. Este es un homologo del sistema RoxS/RoxR de Pseudomonas aeruginosa, el cual pertenece a su vez a la familia RegA/RegB, descrita como un elemento clave en la regulación de la fotosíntesis de algunas bacterias. Los genes que codifican RoxS and RoxR forman un operón y un mutante en roxSR tiene afectada la capacidad de colonización competitiva de la rizosfera. Para esclarecer el regulón RoxS/RoxR de P. putida se llevo a cabo un análisis global transcripcional mediante el uso de microarrays de DNA. Los resultados muestran que ciertas enzimas del metabolismo de aminoácidos, estructuras de superficie, citocromo c, citocromo oxidasa y sistema de transporte de electrones, entre otros, están bajo la influencia de RoxS/R. Este estudio sugiere una integración del balance redox de la célula con una regulación dependiente de densidad celular, donde RoxS/R juega un papel importante. En el capitulo 2 tras confirmar mediante técnicas cromatográmicas y espectrométricas la ausencia de moléculas de quórum sensing descritas hasta el momento en sobrenadantes de Pseudomonas putida KT2440, se procedió al estudio del papel que podría desempeñar la proteína codificada por ppoR (PP_4647). En los sistemas de QS más comunes, este tipo de proteínas de la familia LuxR forman un complejo con la molécula señal de tipo acil-homoserina lactona y tras su unión al DNA, activa o reprime la trascripción de determinados genes de QS. Aquí se ha demostrado que la proteína PpoR de KT2440 modula el movimiento por swarming y esta implicada en la supervivencia de esta cepa en presencia de potenciales competidores. Estas funciones, sin embargo, parecen ser independientes de la respuesta a AHLs, ya que KT2440 no las produce y PpoR no activa la expresión de promotores dependientes de QS, ni siquiera con la adición de AHLs exógenas. Un mutante en ppoR muestra ser mas sensible a la presencia de un agente quelante de hierro (2,2-dipyridyl), mientras que la suplementación de hierro compensa la perdida de adaptabilidad al medio de este mutante en competición con otras especies de Pseudomonas. Estos resultados apuntan que PpoR participa en aquellos procesos biológicos relevantes para la adaptación de KT2440 al medio los cuales están relacionados con la adquisición de hierro y no necesariamente con la actividad de señales de quórum sensing de tipo AHL. Ya que la respuesta de KT2440 a un mecanismo de comunicación celular, ya sea inter- o intraespecifico, esta canalizada por el gen ddcA como determinante de densidad celular poblacional, en el capitulo 3 se abordo la búsqueda de las posibles señales inductoras de ddcA que pudieran ser producidas tanto por la propia P. putida KT2440 como por otros organismos con los que comparte nicho. Sobrenadantes de Pseudomonas aeruginosa fueron capaces de inducir la expresión de ddcA, mientras que aquellos procedentes de mutantes en el sistema QS AHL de esta cepa no lo hacían. Ante el hecho de que ddcA no respondía a AHLs sintéticas, se propone que ddcA es activado por una señal aun desconocida, producida por P. aeruginosa y regulada de alguna manera por el sistema AQ AHL, estableciendo así un 'cross-talk'. Fraccionamiento del extracto de sobrenadantes de P. aeruginosa y posterior análisis espectrometrico de las fracciones positivas, revela un comportamiento apolar correspondiente a un ac graso de cadena larga, identificándose así el ac. dodecanoico y tetradecanoico o un posible derivado cercano, como la señal inductora de ddcA. Exudados de raiz y sobrenadantes de cultivos de KT2440 en fermentadores, donde se alcanza gran biomasa, también resultaron dar positivo en la detección de estos ac. grasos. En el capitulo 4 se encontraron evidencias del efecto negativo que la señal de quórum sensing 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone (Conocida como PQS, Pseudomonas quinolone signal) ejerce en algunos procesos multicelulares de Pseudomonas putida KT2440. PQS es una de las señales integrantes del complejo sistema de QS de Pseudomonas aeruginosa, el cual es responsable de muchos de los determinantes patogénicos por los que se caracteriza esta bacteria, tales como la producción de sideróforos, antibioticos y factores de virulencia o desarrollo de biofilms. PQS no es producida por P. putida KT2440. En este estudio se observó que PQS compromete la formación de biofilms y la movilidad tipo swarming de KT2440, interfiriendo además en la captación de hierro. Por otro lado, la adición de PQS causó cambios en la trascripción de ciertos genes de P. putida, indicando una respuesta especifica a esta molécula. Entre los genes que mostraron incrementada su expresión génica se identifico uno implicado en la síntesis de profagos, lo cual sugiere que PQS pueda incitar la lisis de parte de la población. Todo esto podría indicar que P. aeruginosa emplea PQS como un arma química contra potenciales competidores. La rizosfera de plantas constituye un nicho ecológico en el que múltiples mecanismos de QS tienen lugar. Estos sistemas conectan entre si encontrándose a su vez integrados dentro de otros sistemas celulares de regulación global y sometidos a un continuo cambio de las condiciones ambientales, así como a la presencia y actividades de otros microorganismos. Pseudomonas putida KT2440 no produce ninguna de las señales de QS actualmente conocidas, pero se han encontrado evidencias que sugieren la existencia de un mecanismo de QS propio, no descrito hasta ahora. La caracterización del sistema de QS en esta bacteria puede conducir a la identificación de nuevas moléculas con actividad como señales célula-célula, que pueden jugar un papel importante para una colonización eficaz de la rizosfera, influenciando también el resultado de aquellas interacciones de patógenos con plantas. Por otro lado, procesos de señalización de otras especies bacterianas podrían tener tienen un impacto sobre la fisiología, supervivencia y persistencia de P. putida KT2440. Esta cepa promotora del crecimiento y de resistencia sistémica inducida en la planta podria dirigirse en su uso como agente biocontrol buscando la interferencia con los sistemas de señalización de QS de potenciales competidores que podrían estar involucrados en procesos de patogénesis en raíces de plantas.