Structure and thermodynamics of the cd2ap-sh3 domains and their interaction with ubiquitin

Resumen

El trabajo presentado en esta memoria tenía como objetivo principal la caracterización de los dominios SH3 de la proteína CD2AP, así como de sus interacciones con dianas naturales, en especial ubiquitina, un ligando natural implicado en gran variedad de funciones dentro de la célula, tales como la regulación post-transcripcional de proteínas, señalización celular o transporte a través de la membrana. Este objetivo se consiguió a través de la determinación estructural de las formas libres de los tres dominios SH3 mediante resonancia magnética nuclear (RMN), y la caracterización dinámica y termodinámica de estos mediante RMN y calorimetría diferencial de barrido (CDB). El estudio de las interacciones con ubiquitina se llevó a cabo también mediante RMN tras desarrollar una metodología novedosa para la obtención de la estructura tridimensional de alta resolución de complejos de baja afinidad, como el formado por el tercer dominio SH3 de CD2AP y ubiquitina. De forma más detallada el trabajo desarrollado se resume en: 1. Se clonaron el segundo y tercer dominio SH3 de CD2AP (SH3-B y C) y se purificaron los tres dominios SH3 de CD2AP en condiciones tanto de abundancia isotópica natural como enriquecidos isotópicamente en 13C y/o 15N. 2. Se llevaron a cabo estudios de estabilidad mediante CDB para determinar las condiciones más estables para cada uno de los dominios y para caracterizar su termodinámica de desplegamiento. 3. Se determinaron las estructuras tridimensionales de los tres dominios SH3 mediante la aplicación de distintas metodologías de RMN, tales como experimentos heteronucleares bi- y tridimensionales, acoplamientos dipolares residuales y experimentos homonucleares bidimensionales, lo que nos ha permitido interpretar las diferencias en estabilidad existentes entre ellos mediante una aplicación de cálculo computacional de las contribuciones a la estabilidad a partir de la estructura tridimensional. De esta forma se pudieron establecer también las diferencias estructurales que puedan afectar a las interacciones con sus dianas naturales. Los resultados obtenidos en la determinación de la estructura tridimensional del dominio SH3-C han sido recogidos en una publicación científica en la revista Journal of Biomolecular NMR (Ortega-Roldan et al. 2007). 4. Se llevó a cabo un estudio de la dinámica y termodinámica de la cadena principal mediante relajación de 15N e intercambio hidrógeno deuterio para comprender la flexibilidad exhibida por estos dominios en disolución así como sus determinantes moleculares y poder relacionarla con la función biológica que desempeñan dentro de la célula. Los resultados descritos en los apartados 1 a 3 han sido enviados para su publicación en la revista Protein Science (Ortega-Roldan et al. 2010). 5. Con el fin de poder abordar la determinación estructural de complejos macromoleculares de baja afinidad se desarrolló una metodología novedosa que emplea acoplamientos residuales dipolares medidos mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Este estudio se recoge en una publicación científica en la revista Nucleic Acid Research (Ortega-Roldan et al, 2009). 6. Por último, se caracterizaron las interacciones de los tres dominios SH3 de CD2AP con ubiquitina. Se elaboró un modelo estructural del complejo formado por el dominio SH3-A y ubiquitina y se determinó la estructura tridimensional de alta resolución del complejo formado por el dominio SH3-C y ubiquitina. Para comprender las diferencias entre ambas estructuras se elaboraron mutantes y se llevaron a cabo titulaciones monitorizadas mediante RMN, ITC y fluorescencia. Este análisis se completó con un estudio comparativo de todos los dominios SH3 capaces de interaccionar con ubiquitina. Los resultados obtenidos en este estudio han sido enviados para su publicación en la revista The Journal of Biological Chemistry.