Síntesis, fotofísica y aplicación a la espectroscopía de correlación de fluorescencia de derivados xanténicos útiles como sondas fluorescentes "on/off

Resumen

La característica fundamental comúnmente buscada en las sondas fluorimétricas es que su fluorescencia antes de reaccionar o enlazarse a una biomolécula sea prácticamente nula, pero que resulte altamente fluorescente después de la reacción o enlace. Con el objetivo de encontrar nuevos colorantes que presenten ese comportamiento on/off y que conserven las ventajosas características de la fluoresceína, se ha llevado a cabo la síntesis de dos derivados de fluoresceína en los que el grupo carboxilo (del ácido benzoico) se ha sustituido por otro grupo no ionizable. Los compuestos son: el 9-[1-(2-metil-4-metoxifenil)]-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (TG-I) y el 9-[1-(2-metoxi-5-metilfenil)]-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (TG-II). Con ambos compuestos se pretende realizar el estudio detallado de su fotofísica y de las reacciones de transferencia protónica en el estado excitado, entre la forma aniónica (fluorescente) y la forma neutra (poco fluorescente), así como las implicaciones de las mencionadas reacciones en la función de autocorrelación de fluorescencia a nivel de moléculas individuales. Para ello, después de realizar la síntesis de estos compuestos, se estudiará, mediante espectroscopia de absorción y de fluorescencia en estado estacionario, la sensibilidad a la fuerza iónica del pKa aparente. Seguidamente se estudiará, por métodos fluorimétricos en estado estacionario, la reacción de transferencia protónica en el estado excitado (ESPT) mediada por un tampón de fosfatos. Una vez establecida la existencia de la mencionada reacción en el estado excitado, se propondrá un modelo en dos estados excitados que describa la dinámica del proceso, y mediante la aplicación del análisis global compartimental (GCA)1 a la superficie multidimensional de decaimientos de fluorescencia, recogidos en función de la longitud de onda de emisión, pH y concentración de tampón de fosfatos, se recuperarán las constantes cinéticas de velocidad que describen el comportamiento dinámico del sistema, a nivel de conjunto. Ya que la aplicación de los parámetros cinéticos y espectrales obtenidos a los modelos propuestos, posee un gran poder de predicción, calcularemos el tiempo que tarda el sistema en alcanzar el acoplamiento en los decaimientos de la fluorescencia de las especies reactivas. Así mismo, se podrán predecir los tiempos de vida de disoluciones del colorante a distintas condiciones experimentales y efectuar el cálculo de la señal de fluorescencia en estado estacionario que se obtendría a partir de estas disoluciones.2,3 El estudio a nivel de moléculas individuales constará de dos partes, en la primera se recogerán los tiempos de vida de fluorescencia a nivel individual y se compararán con aquellos obtenidos a nivel de conjunto. Sin embargo, más importante aún es desarrollar experimentalmente la idea de que la presencia de reacciones ESPT debe de afectar a los resultados obtenidos mediante otra técnica fluorescente estándar, la Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia (Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS), ya que las fluctuaciones de la señal de fluorescencia debidas a la rápida cinética de intercambio protónico, deben de reflejarse en la función de autocorrelación. Esta cuestión es de interés porque, hasta donde alcanza nuestro conocimiento, nunca se han tenido en cuenta las consecuencias que tienen las reacciones en el estado excitado sobre la mencionada función de autocorrelación. Se debe de destacar que el trabajo se pretende realizar en términos comparativos, al objeto de escoger cual de los dos compuestos tiene mayor potencial para su utilización como sonda fluorescente a nivel de moléculas individuales. Referencias (1)Crovetto, L.; Orte, A.; Talavera, E. M.; Alvarez-Pez, J. M.; Cotlet, M.; Thielemans, J.; De Schryver, F. C.; Boens, N. J. Phys. Chem. B 2004, 108, 6082-6092. (2) Alvarez-Pez, J. M.; Ballesteros, L.; Talavera, E. M.; Yguerabide, J. J. Phys. Chem. A 2001, 105, 6320-6332. (3) Orte, A.; Bermejo, R.; Talavera, E. M.; Crovetto, L.; Alvarez-Pez, J. M. J. Phys. Chem. A 2005, 109, 2840-2846.