Potencialidad queratinocítica de las células madre de la gelatina de Wharton para su utilización en ingeniería tisular

Resumen

INTRODUCCIÓN: La piel es el órgano más extenso del cuerpo. Supone aproximadamente el 15% del peso corporal total. La capa basal contiene las únicas células proliferativas dentro de la epidermis. Fisiológicamente presenta una de las funciones elementales ya que es el órgano que nos sirve como barrera inicial frente a gran número de agresiones tanto biológicas como ambientales. Por su exposición, sufre innumerables lesiones que, en ocasiones, son capaces de destruir la membrana basal con la consecuente imposibilidad para su regeneración. En estas ocasiones, es preciso recurrir a la realización de injertos para cubrir tales defectos. Del mismo modo, la mucosa oral se ve afectada por numerosas patologías, siendo un tejido para el cuál no existe sustitución posible por otro tejido de las mismas características. Para solventar estos problemas, se propone la realización de piel artificial y mucosa oral a partir de células madre, cultivándolas en un soporte que suponga un estroma lo más similar posible a las condiciones iniciales del paciente. Una de las fuentes más abundantes y accesibles de células madre es el cordón umbilical. En concreto, en el cordón umbilical podemos encontrar células mesenquimales multipotenciales de la gelatina de Wharton y células endoteliales vasculares (HUVEC), las cuales pueden obtenidas y almacenadas en Bancos de Tejidos para su utilización para la generación de órganos y tejidos artificiales mediante ingeniería tisular. OBJETIVOS: El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es la obtención de un sustituto de la piel humana de espesor completo utilizando células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical y diferentes tipos de sustratos estromales. Para ello, se establecerán los siguientes objetivos: 1. Aislamiento y cultivo de células madre de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano, fibroblastos de la dermis y fibroblastos de la lámina propia de la mucosa oral humana. 2. Generación de un sustituto de la piel humana utilizando un estroma de fibrina y agarosa con fibroblastos de la piel humana y células de la gelatina de Wharton. 3. Generación de un sustituto de la piel humana utilizando un estroma de fibrina y agarosa con fibroblastos de la mucosa oral humana y células de la gelatina de Wharton. 4. Evaluación in vivo de los sustitutos de la piel humana y de mucosa oral humana en un modelo de animal inmunodeficiente. 5. Determinar la expresión de proteínas características de función epidérmica en los sustitutos de piel y mucosa oral humanas mediante microscopía óptica e inmunohistoquímica. METODOLOGÍA: Para la generación de cultivos primarios, se obtendrán biopsias de la piel y la mucosa oral humana, las cuales se tratarán enzimáticamente con tripsina y colagenasa. La obtención de las células de la gelatina de Wharton se realizará a partir de pequeños fragmentos del cordón umbilical donados para fines de investigación. Todas las células se cultivarán en medios específicos enriquecidos con hormonas y factores de crecimiento. La construcción de los sustitutos de la piel se realizará utilizando soportes de fibrina y agarosa (Alaminos et al., 2006 Y 2007; Sánchez Quevedo et al., 2008). La evaluación in vivo se realizará mediante implante quirúrgico en ratones atímicos desnudos y seguimiento evolutivo del injerto durante 30 días. Las proteínas a analizar mediante inmunohistoquímica corresponderán a marcadores de citoqueratinas, involucrina e integrinas utilizando anticuerpos específicos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Time-course study of histological and genetic patterns of differentiation in human engineered oral mucosa. Alaminos M, Garzón I, Sánchez-Quevedo MC, Moreu G, González-Andrades M, Fernández-Montoya A, Campos A. J Tissue Eng Regen Med. 2007 Sep-Oct;1(5):350-9. Histological and histochemical evaluation of human oral mucosa constructs developed by tissue engineering. Sanchez-Quevedo MC, Alaminos M, Capitan LM, Moreu G, Garzon I, Crespo PV, Campos A. Histol Histopathol. 2007 Jun;22(6):631-40. Construction of a complete rabbit cornea substitute using a fibrin-agarose scaffold. Alaminos M, Del Carmen Sánchez-Quevedo M, Muñoz-Avila JI, Serrano D, Medialdea S, Carreras I, Campos A. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006 Aug;47(8):3311-7.