Estudio del metabolismo del formaldehído en pseudomonas putida kt2440

Resumen

El formaldehído es un compuesto tóxico para todos los seres vivos debido a su alta reactividad con componentes celulares como los ácidos nucleicos y las proteínas. El formaldehído se considera un contaminante ubicuo que está presente en el aire y en el agua. Además dicho compuesto es un subproducto en el metabolismo de la histidina y compuestos naturales metoxilados, y dado su origen biogénico los seres vivos han desarrollado diversos mecanismos de detoxificación de formaldehído. La detoxificación implica usualmente la acción concreta de distintos sistemas enzimáticos entre los que se incluyen formaldehído deshidrogenasas y formato deshidrogenasas que son capaces de degradar el formaldehído a CO2. En este trabajo se ha puesto de manifiesto que en P. putida KT2440 el formaldehído se detoxifica a CO2 a través del sistema formaldehído deshidrogenasa-formato deshidrogenasa. En esta Tesis Doctoral hemos realizado el primer análisis transcriptómico de la respuesta de P. putida KT2440 a concentraciones subletales de formaldehído, hecho que ha ayudado a comprender mejor la respuesta inicial de la cepa a este compuesto químico y a identificar un conjunto de genes implicados en dicha respuesta. Nuestros resultados apoyan que P. putida es resistente a formaldehído y dicha resistencia parece implicar la detoxificación mediante la conversión del tóxico a CO2, extrusión de la molécula por medio de la bomba de eflujo MexEF-OprN, inducción de enzimas que reparan el ADN dañado y chaperonas que corrigen a nivel de proteínas el daño directo provocado por el formaldehído o el de sus efectos laterales como los daños oxidativos. Hemos analizado la organización física y transcripcional de los genes que codifican las formaldehído deshidrogenasas y formato deshidrogenasas en KT2440 observando que KT2440 posee 2 formaldehído deshidrogenasas (PP0328 y PP3970) y dos complejos formato deshidrogenasa (PP0489-PP0492 y PP2183-PP2186). Los promotores de dichos productos génicos son promotores no canónicos que se expresan a niveles basales en la fase de crecimiento exponencial y a niveles más altos en la fase estacionaria independientemente de la presencia extracelular de formaldehído o formato. Se han construido mutantes con mutaciones simples o dobles en las formaldehído deshidrogenasas y formato deshidrogenasas y los resultados muestran que dichos productos génicos contribuyen en la mineralización de formaldehído y formato. Además, el doble mutante en las dos formaldehído deshidrogenasas y el doble mutante en las formato deshidrogenasas continuaban oxidando formaldehído a CO2, sugiriendo una redundancia de funciones que no sólo se limita a los genes anotados. No obstante, las largas fases de latencia presentadas por los mutantes simples y dobles en comparación con las que presentaba la cepa parental cuando se cultivaban con concentraciones de formaldehído cercanas a las MICs sugieren que dichos sistemas de detoxificacion podrían tener un papel en la tolerancia a concentraciones subletales de formaldehído. En KT2440 los ORFs PP0257 (fdhD) y PP0492 (fmdD) estaban anotadas originalmente como proteínas accesorias formato deshidrogenasa. fmdD es adyacente al operón formato deshidrogenasa (PP0489-PP0491), y se transcribe con él preferentemente en fase estacionaria. fdhD no está ligado a las agrupaciones génicas formato deshidrogenasa y, se expresa en la fase estacionaria de crecimiento, aunque su transcripción puede ser mediada por RpoD o RpoS. El nivel de expresión transcripcional de fdhD se ve incrementado en respuesta a formaldehído o formato o con compuestos químicos que rinden estos compuestos C1 en algún paso de su metabolismo. A pesar de estas correlaciones, la inactivación de PP0257 no producía un efecto significativo en la actividad formato deshidrogenasa in vivo, mientras que la inactivación de PP0492 llevaba a un descenso del 60%. Estos resultados sugieren que la redundancia de funciones en el metabolismo del formaldehído en P putida se extiende hasta las proteínas implicadas en la maduración/localización de los complejos formato deshidrogenasa.