Respuestas inducidas por ácido salicílico y ácido abscísico en las simbiosis de judía y alfalfa en estrés salino

Resumen

Las leguminosas representan un conjunto de cultivos de extraordinaria importancia, tanto desde la perspectiva de la calidad del producto de explotación (grano o forraje), debido a su elevado contenido en proteínas de origen vegetal, como al efecto mejorador del suelo, constituyendo un factor clave de la sostenibilidad de la producción agraria. El interés económico de las leguminosas está relacionado con su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico, cuando forman simbiosis con los rizobios específicos del suelo en sus nódulos radicales, favoreciendo la reducción del coste de fertilizantes, evitando la contaminación ambiental y contribuyendo a la sostenibilidad agrícola. La fijación biológica de nitrógeno está presente en numerosos ecosistemas, siendo evidente que el medio ambiente ejerce una influencia sobre este proceso, por lo que las fluctuaciones en la productividad se deben en gran parte a la baja tolerancia a factores abióticos adversos. La salinidad es uno de los principales factores limitantes en la productividad de leguminosas en regiones áridas y semiáridas afectadas por la acumulación de sales inorgánicas en el agua de riego o en el suelo, particularmente cuando la planta depende de la fijación simbiótica para sus requerimientos de nitrógeno. La sensibilidad de este proceso a la salinidad, requiere la adaptación de ambos simbiontes, siendo en la simbiosis Rhizobium-leguminosa la planta hospedadora más sensible a la sal y al estrés osmótico que el rizobio, aunque el exceso de sales en el suelo afecta tanto al proceso de infección y desarrollo del nódulo como al funcionamiento y eficacia de la fijación. La adaptación de las plantas a la salinidad es un proceso complejo que involucra cambios a nivel fisiológico, bioquímico y molecular. Entre los cambios metabólicos de respuesta a este estrés, está la acumulación de solutos compatibles intracelulares, que incluso a altas concentraciones no interfieren con los procesos celulares vitales y contribuyen al ajuste osmótico, y al mantenimiento del equilibrio iónico, también se activa la biosíntesis de moléculas y enzimas protectoras del estrés para prevenir o limitar la toxicidad de las especies reactivas del oxígeno que incrementan con la salinidad. Estos procesos pueden estar regulados por moléculas hormonales que desencadenan y dirigen los mecanismos de protección al estrés. El ácido abscísico (ABA) es una hormona vegetal involucrada en diversos procesos fisiológicos incluyendo las respuestas de adaptación a condiciones ambientales adversas, como salinidad, sequía o estrés térmico. El ABA favorece la osmoregulación e induce procesos de defensa mediante la activación a nivel molecular y genético de proteínas y otras moléculas que contrarrestan los efectos negativos inducidos por el estrés salino. Además, se establece su implicación en neutralizar los efectos producidos por el estrés oxidativo que se genera en la mayoría de los estreses abióticos. El ácido salicílico (AS) es una hormona vegetal involucrada en los mecanismos de defensa y/o de protección frente a estreses bióticos (ataque de patógenos) habiéndose discutido en los últimos años el papel que realiza en la interacción simbiótica de leguminosas y Rhizobium, evidenciando que interviene tanto en el proceso de formación de nódulos como en la regulación de las respuestas de protección de la planta infectada con Rhizobium. También está involucrado en el desencadenamiento de la cascada de respuestas frente a estreses abióticos, asignándole un papel modulador como agente protector. La aplicación exógena de ácido salicílico y ácido abscísico como agentes que favorecen la tolerancia a estreses abióticos en general, y salino en particular, pueden ayudar a conocer el papel regulador de estas moléculas en los mecanismos de adaptación al estrés salino en el nódulo y en la planta. Los resultados obtenidos potencialmente podrán ser transferidos y utilizados por mejoradores, biotecnólogos o manipuladores de plantas de cultivos agrícolas en estas condiciones. Este trabajo se ha llevado a cabo en dos simbiosis: la establecida entre una leguminosa grano Phaseolus vulgaris y Rhizobium tropici, en la que se forman nódulos determinados, y la formada entre una leguminosa forrajera Medicago sativa y Sinorhizobium meliloti en la que se forman nódulos indeterminados. Ambos tipos de nódulos muestran diferencias en su génesis, en su anatomía, y en el metabolismo nitrogenado. El objetivo general de esta Tesis Doctoral es determinar los mecanismos y/o estrategias que adoptan las leguminosas en simbiosis en condiciones de salinidad conectando estos mecanismos de respuesta con el proceso de fijación de nitrógeno. La hipótesis de partida se centra en abordar posibles sistemas de adaptación o supresión del daño originado por el estrés salino como son la formación de osmolitos, cambios metabólicos en enzimas claves en el funcionamiento del nódulo radical, alteraciones en los sistemas de defensa antioxidantes en respuesta al estrés y cambios en el estatus hormonal inducido por la salinidad, centrándonos en el ácido salicílico y ácido abscísico como hormonas claves implicadas. Las conclusiones de la tesis son las siguientes: 1. En la ontogenia del cultivo de Medicago sativa 150 mM de NaCl ejerce un efecto negativo en el crecimiento que conlleva a una alteración de la relación raíz/parte aérea indicando que la parte aérea de la planta es más sensible a la sal que la raíz, también afecta a la actividad fotosintética, (determinada como Fv/Fm eficiencia fotoquímica FSII) reduciendo tanto el aporte de fotoasimilados al nódulo, como las actividades enzimáticas del metabolismo carbonado nodular. La máxima actividad de este proceso se adelanta de crecimiento reproductor a vegetativo con la salinidad. 2. La simbiosis Medicago sativa-Sinorhizobium meliloti se puede considerar moderadamente tolerante a la salinidad manteniendo la máxima fijación de nitrógeno al inicio de floración (periodo reproductor) así como la asimilación de amonio, no obstante la actividad aspartato aminotransferasa y glutamato deshidrogenasa pueden ser alternativas al ciclo GS/GOGAT cuando el estrés salino es más intenso. 3. El pretratamiento con ácido salicílico a semillas de Phaseolus vulgaris favorece la acumulación de salicílico endógeno en hoja y raíz de plántulas, que no ocurre con la salinidad. En estas condiciones, el pretratamiento con AS no favorece la producción de prolina, azúcares solubles totales, peroxidación lipídica y la activación de enzimas antioxidantes, pudiéndose asumir que el AS induce la aclimatación de las plántulas al estrés salino, mejorando el crecimiento vegetal y reduciendo el daño en las membranas. 4. En general, el ácido salicílico y el abscísico reducen el crecimiento y el proceso de fijación de nitrógeno en Phaseolus vulgaris y Medicago sativa con distinta sensibilidad, no obstante en ambas leguminosas el efecto de la salinidad es más drástico que el ejercido por las hormonas vegetales. Sin embargo, tanto el ácido salicílico como el abscísico logran mitigar o paliar los efectos adversos provocados por el estrés salino, aunque con matices: el ABA induce una recuperación del crecimiento y fijación de nitrógeno en ambas especies de leguminosas, mientras que el AS ejerce una respuesta rápida en la mejora del crecimiento de las plantas pero no en la fijación de nitrógeno. 5. En las dos simbiosis la salinidad provoca un estrés oxidativo que induce la peroxidación lipídica. El ciclo ascorbato-glutation es muy activo en nódulos de Medicago sativa, por lo que tienen mayor capacidad antioxidante que los de Phaseolus vulgaris. El desencadenamiento que induce el AS y el ABA en los distintos sistemas antioxidantes (moléculas y enzimas) es diferente: el AS regula el incremento de las actividades superóxido dismutasa y peroxidasa, y la disminución de catalasa, mientras que el ABA induce la catalasa, peroxidasa y dehidroascorbato reductasa. El AS favorece el ajuste osmótico con la acumulación de azúcares solubles totales en hoja y nódulo de las dos leguminosas, osmolitos que no son potenciados por el ABA. 6. La catalasa nodular es más activa que la foliar tanto en judía como en alfalfa, lo que pone de manifiesto las elevadas condiciones reductoras del nódulo. La catalasa de ambos órganos se afecta con la sal en las dos leguminosas, sin embargo los experimentos in vitro demuestran que sólo la de hoja de Medicago sativa y la de nódulo de Phaseolus vulgaris son particularmente sensibles al NaCl. La catalasa foliar de judía es más activa en el crecimiento vegetativo y se reduce en el reproductor, mientras que en alfalfa el máximo se alcanza en el reproductor y en la senescencia nodular. 7. Se ha purificado y caracterizado la catalasa nodular de Phaseolus vulgaris y Medicago sativa mediante cromatografía de exclusión molecular e IMAC, estimándose el peso molecular en 59 y 48 kDa en judía y en 88 y 53 kDa en alfalfa, y por SDS en 42 kDa en judía y 46 kDa en alfalfa. La sensibilidad de la enzima con algunos inhibidores depende del tipo de nódulo (determinado o indeterminado), así el mercaptoetanol y el ditiotreitol son inhibidores más potentes de la enzima en nódulos indeterminados de alfalfa.