Structural determinants for snare-mediated neurosecretion

Resumen

Uno de los objetivos principales en neurociencia es comprender los mecanismos moleculares involucrados en el funcionamiento del cerebro, un complicado sistema de neuronas que se comunican entre ellas mediante la liberación de neurotransmisores de la sinapsis. La liberación de los neurotransmisores requiere la fusión de la vesícula sináptica con la membrana plasmática. Un paso esencial para este proceso es la interacción entre una proteína de la vesícula sináptica (VAMP2) y dos proteínas de la membrana plasmática (syntaxin1A y SNAP-25), mediante unos dominios citoplasmáticos especializados llamados dominios SNARE. Esta interacción conlleva la formación de un complejo ternario energéticamente favorable llamado complejo SNARE que acerca las dos membranas (vesicular y plasmática) permitiendo así su fusión. Para llevar a cabo un proceso individual de fusión vesicular se precisa que múltiples complejos SNARE actúen de manera cooperativa. Sin embargo, el mecanismo molecular mediante el cual los complejos SNARE multimerizan aún se desconoce. En este trabajo hemos identificado y caracterizado in vitro un dímero de complejos SNARE neuronales. Dicha dimerización da lugar a una estructura abierta de dos alas en la cual dos complejos SNARE interaccionan mediante sus extremos carboxilo terminales, involucrando al menos tres aminoácidos de VAMP2 (R86, W89 y W90). Las mutaciones en estos residuos afectan significativamente a la estabilidad de los dímeros in vitro, e inhiben la neurosecreción in vivo. Estos resultados nos indican que los dímeros de complejos SNARE desempeñan un papel importante en la liberación de neurotransmisores. Además de los dominios citoplasmáticos de las proteínas SNARE, sus dominios transmembrana (TMs) también tienen un papel importante en la fusión de membranas. Sin embargo, los requerimientos estructurales y funcionales de estos dominios aún se desconocen. En este trabajo hemos desarrollado un ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) in vivo para visualizar interacciones entre moléculas de VAMP2 mediadas por sus TMs donde participa un residuo de glicina (G100). La sustitución de este aminoácido por otros de mayor tamaño (valina o tirosina) impide la dimerización de los TM de VAMP2. Sin embargo, estas mutaciones (G100V y G100Y) no afectan a la neurosecreción, los que nos indica que la dimerización de los TMs de VAMP2 no juega un papel importante en la fusión vesicular. Sin embargo, la deleción o inserción de aminoácidos en la mitad carboxilo del TM de VAMP2 produce una fuerte inhibición de la neurosecreción, mientras que alteraciones similares generadas en la mitad amino no dan lugar a defectos en la secreción. Nuestros resultados indican que existen requerimientos estructurales distintos entre las mitades amino y carboxilo del TM de VAMP2, y que la mitad carboxilo es esencial para la secreción de neurotransmisores mediada por SNARE. Sumary A major goal in neuroscience is to understand the molecular mechanisms underlying brain function. A complicated network of neurons communicate with each other by releasing neurotransmitters at synapses. Such neurotransmitter release requires the fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane. A crucial step in membrane fusion is the interaction between a synaptic vesicle protein (VAMP2) and two plasma membrane proteins (syntaxin1A and SNAP-25) through their specialized cytoplasmic motifs termed SNARE motifs, leading to the formation of an energetically favourable core complex that brings both membranes into apposition to allow membrane fusion. Multiple SNARE complexes cooperate to bring about an individual vesicular fusion event, but the exact molecular mechanism(s) responsible for SNARE complex multimerization remain unclear. Here, we report the molecular identification and characterization of a dimer formed between the cytoplasmic portions of neuronal SNARE complexes in vitro. Dimerization generates a novel two-winged open structure where the two complexes interact through their C-terminal ends, involving three residues (R86, W89 and W90) from VAMP2. Mutations on these residues significantly reduces the stability of SNARE complex dimers in vitro and lead to a corresponding decrease in neurosecretion in vivo. The reported findings are consistent with an important role for such SNARE complex dimerization in neurotransmitter release. In addition to the cytoplasmic domains of the SNARE proteins, their transmembrane domains (TMDs) clearly contribute to membrane fusion as well. However, the precise structural and functional requirements remain largely unknown. Here we have used a bimolecular fluorescence complementation approach (BiFC) to provide in vivo evidence for individual VAMP2 molecule interactions mediated by the TMDs and involving a glycine residue (G100). Replacing the glycine residue with amino acids of increasing molecular volume abolishes such VAMP2 dimerization without affecting neurosecretion. These results suggest that dimerization of the TMDs of VAMP2 does not play an important functional role. In contrast, deleting or inserting residues within the C-terminal half of the VAMP2 TMD causes a severe inhibition of exocytosis, while similar alterations within the N-terminal half do not result in secretory deficits. Our results indicate that distinct structural requirements exist between the N- and C-terminal halves of the VAMP2 TMD, with the C-terminal part being essential for SNARE-mediated neurotransmitter release.