Caracterización funcional de las quinasas tor (target of rapamycin) en trypanosoma brucei

Resumen

La tripanosomiasis humana africana (THA), también conocida como la enfermedad del sueño, es causada por el protozoo parásito Trypanosoma brucei. Esta enfermedad, mortal sin tratamiento médico, afecta a medio millón de personas (Barrett et al., 2003) y produce grandes pérdidas en la cabaña ganadera del África subsahariana. El desarrollo de una vacuna eficaz se ve obstaculizado por la variación antigénica del parásito (Cross, 1975). Asimismo, los fármacos utilizados para tratar la THA muestran una elevada toxicidad o una baja efectividad en la fase neurológica de la enfermedad. Por lo tanto, uno de los grandes retos en este campo es el hallazgo de dianas terapéuticas válidas, entre las que destaca el grupo de las protein-quinasas (Parsons et al., 2005), enzimas encargadas de regular procesos biológicos esenciales para la viabilidad celular. El conocimiento de las rutas de señalización en tripanosomas es muy limitado. Hasta ahora, los principales esfuerzos en este sentido se han centrado en la caracterización de quinasas involucradas en proliferación celular (Hammarton, 2007), desconociéndose aquellas otras implicadas en el proceso de crecimiento celular. Una de las proteínas centrales en el control del crecimiento celular en eucariotas es la quinasa "Target of Rapamycin" (TOR). TOR regula de manera global el crecimiento celular en función del estatus metabólico y nutricional. En concreto, TOR regula dos aspectos bien diferenciados del crecimiento: en primer lugar, regula cuando se debe producir el crecimiento, dependiendo de la disponibilidad de nutrientes, y en segundo lugar, regula la zona hacia la que debe producirse dicho crecimiento. Estos dos aspectos son regulados por TOR a través de su unión a dos complejos mutiproteicos distintos, denominados TORC1 y TORC2 (TORC, TOR-containing complex), encargados de regular dos cascadas de señalización diferentes (revisado por (Hall, 2008)). La función esencial de la quinasa TOR en el control del crecimiento celular en mamíferos y levaduras sugiere que puede constituir una nueva y valiosa diana terapéutica frente a T. brucei. En esta tesis doctoral se ha estudiado la función de las proteínas TOR en la forma infectiva de T. brucei, así como la inhibición de su actividad mediante el uso de rapamicina. El desarrollo de una serie de herramientas moleculares en T. brucei nos ha permitido estudiar la función de las proteínas de la familia TOR en el crecimiento celular. Entre ellos, cabe destacar la obtención de sistemas de expresión heterólogos de proteínas, la generación de anticuerpos y de líneas celulares para realizar tanto la expresión de genes de forma inducible por tetraciclina como la expresión de RNAs de interferencia. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que tanto TbTOR1 como TbTOR2 controlan el crecimiento celular a través de la regulación de múltiples procesos celulares. El análisis funcional mediante RNAi, sugiere que la actividad de TbTOR1, llevada a cabo a través del complejo TORC1, promueve la síntesis de proteínas, la progresión del ciclo celular y la localización de la RNA polimerasa I de en el nucleolo, mientras que su falta de función resulta en la aparición de vacuolas de doble membrana similares a vesículas autofágicas. Así, nuestros datos sugieren que TbTOR1 favorece aquellos procesos destinados a aumentar la masa y tamaño celular. Por el contrario, la quinasa TbTOR2, la cual forma parte del complejo TORC2, juega un papel fundamental en el mantenimiento de la polarización del citoesqueleto de actina, requerida para el correcto funcionamiento de los procesos endocíticos de la forma sanguínea de T. brucei. Además, la actividad de TbTOR2 también es necesaria para completar de manera satisfactoria el proceso de división celular o citocinesis. Por lo tanto, las funciones de TOR en este protozoo parásito están conservadas si se comparan con las descritas en levaduras y mamíferos. Sin embargo, en este trabajo se describe por primera vez otras dos quinasas pertenecientes a la familia TOR, TbTOR-like 1 y TbTOR-like 2. Estas quinasas presentan una estructura por dominios similar a la que presentan las proteínas TOR, aunque nuestros resultados sugieren que no son componentes de las rutas clásicas TORC1 o TORC2. En concreto, TbTOR-like 2 regula aspectos del crecimiento no relacionados con aquellos llevados a cabo por el TORC1 y el TORC2. Nuestros resultados muestran que la depleción parcial de TbTOR-like 2 en la forma sanguínea promueve un proceso de preadaptación de la maquinaria celular al ambiente presente en la mosca tsetse, un mecanismo de adaptación celular necesario para realizar el cambio de hospedador durante el desarrollo del ciclo de vida de T. brucei. En lo que se refiere a la inhibición de las quinasas TbTOR mediante el uso de moléculas químicas, en primer lugar se ha mostrado que la rapamicina es un potente inhibidor de la proliferación de la forma sanguínea de T. brucei. Observamos que dicho efecto era debido a una alteración en el proceso de citocinesis, fenotipo distinto al generado en otros organismos eucariotas. Los datos obtenidos en esta tesis sobre el mecanismo de acción de la rapamicina a nivel molecular revelaron que el efecto tripanocida era ejercido a través de la inhibición específica del complejo TbTORC2, mientras que el complejo TORC1 permanece inalterado, efecto contrario al observado en mamíferos y levaduras. Los resultados obtenidos en esta tesis constituyen un importante avance tanto en el conocimiento de las cascadas de señalización en Trypanosoma brucei como en la caracterización del mecanismo de acción de rapamicina. Desde el punto de vista farmacológico, la validación de las quinasas TOR como diana de acción de fármacos establecen las bases para futuros estudios encaminados al diseño de moléculas que actúen específicamente en el parasito, impidiendo así su proliferación.