Asociación de genes candidatos a esclerosis múltipleestudio funcional del gen de la il-2

Resumen

RESUMEN La esclerosis múltiple (EM), un desorden inflamatorio del sistema nervioso central, se caracteriza por la perdida de mielina, gliosis y varios grados de patología en axones y oligodendrocitos. Como en todas las enfermedades complejas, en EM se cree que existe una interacción entre factores ambientales, aun no identificados, y genes de susceptibilidad (Dyment, 1997). Conjuntamente, estos factores desencadenan una cascada de efectos, que comprenden la implicación del sistema inmune, inflamación aguda de axones y glia, recuperación de funciones y reparación de estructuras, gliosis post-inflamatoria y neurodegeneración. La implicación secuencial de estos procesos se refleja en el curso clínico caracterizado por episodios de recuperación, de deficiencias en el estado físico del paciente y una progresión secundaria (Lublin & Reingold, 1996). La EM presenta un amplio rango de fenotipos clínicos y patológicos. Un único mecanismo predominante de desarrollo de la enfermedad no ha surgido todavía aunque estudios inmunopatológicos en EM mas datos en modelos animales presentan evidencias convincentes de una patología inmuno-mediada (Lassmann, 2008). EM es una de las enfermedades descapacitantes crónicas más comunes del sistema nervioso central que afectan más frecuentemente a población caucasiana (hasta un 15%), con alrededor de 2,5 millones de individuos afectados en el mundo. En España la prevalencia de la EM es de 50 a 70 individuos por cada 100.000 habitantes (Fernandez et al., 1994; Ares et al., 2007). La enfermedad comienza normalmente en adultos jóvenes y afecta a mujeres con más frecuencia que a hombres. Estudios epidemiológicos y de familias apoyan fuertemente el papel de los factores genéticos en la patogénesis de la EM. Los miembros de familias con algún miembro afectado con EM tienen un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad comparado con los esposos o hijos adoptados de los pacientes de EM (Sadovnick et al., 1993). El riesgo es mayor en gemelos y hermanos y menor en hijos y medio-hermanos. La distribución del riesgo en familias es indicativa de un modelo de heredabilidad poligénico. Numerosos estudios genéticos de ligamiento realizados a finales de los 90 a partir de familias o estudios de asociación con un número discreto de marcadores y bajo poder estadístico determinaron más de 50 loci con una muy baja coincidencia entre diferentes estudios a excepción de la región del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA), aunque proporcionaron información sobre el bajo efecto de los loci individuales en la enfermedad sugiriendo que un número considerable de genes con efectos relativamente pequeños estarían implicados en la susceptibilidad a EM. Al principio de esta tesis el único locus de susceptibilidad a EM claramente confirmado en múltiples estudios tanto de ligamiento como de asociación era HLA de clase II. Posteriormente se ha definido el haplotipo HLA- DQB1*0602-DQA1*0102 -DRB1*1501-DRB5*0101 como el que incrementa el riesgo a padecer EM (Oksenberg et al., 2008). Sin embargo, se desconoce si los propios alelos de susceptibilidad en los genes de HLA o otros en desequilibrio de ligamiento con ellos son los responsables del incremento de susceptibilidad en los pacientes. Sistema de la Inrterleuqina-2 (IL2) / receptor de la IL2 (IL2R) y su implicación en la EM El reciente descubrimiento de la importancia de las células T reguladoras (Treg) (CD4+CD25high) en la tolerancia inmunológica y regulación inmune (Fontenot et al., 2005) hacen a los genes del sistema de la IL2/IL2R interesantes candidatos para la susceptibilidad a EM. La autoinmunidad asociada con deficiencias en IL2/IL2R puede deber principalmente al fallo en la producción de células Treg. Esta dependencia crucial de IL-2 en el desarrollo tímico, homeostasis periférica y transmisión de señales en células Treg es mediada por el IL2R (Malek, 2008). Se ha sugerido que defectos persistentes en la función efectora de las Treg en pacientes de EM son responsables de la inadecuada respuesta específica de antígeno en células T (Viglietta et al., 2004; Haas et al., 2007). También se ha visto afectada la función de las células periféricas Treg en pacientes de diabetes tipo 1 (DT1), soriasis, miastenia gravis autoinmune y artritis reumatoide (AR) (Sugiyama et al., 2005; Lindley et al., 2005; Balandina et al., 2003). Estudios en el modelo experimental de EM, encefalitis autoinmune experimental (EAE), proporcionaron evidencias de la implicación del locus del IL2 en la susceptibilidad y severidad a EM, sugiriendo que esta citoquina pudiera jugar un papel crucial en procesos autoinmunes del sistema nervioso central (Petitto et al., 2000; Encinas et al., 1999). Polimorfismos en el promotor mínimo del il2 de ratón que afectan la actividad transcripcional se han propuesto como candidatos a susceptibilidad en varios modelos de enfermedades autoinmunes como EAE, diabetes dependiente de insulina (en ratones NOD) y disgénesis ovárica autoinmune. Se ha visto que una menor producción intrínseca de la IL2 en el modelo de ratón NOD aumenta la susceptibilidad a diabetes (Yamanouchi et al., 2007). La secreción de IL-2 se encontró significativamente inhibida en PBMCs estimuladas de pacientes de EM tanto en remisiones como recaídas (Selmaj et al., 1988; Wandinger et al., 1997), de forma similar, a lo que se ha descrito para otras enfermedades autoinmunes como DT1 (Roncarolo et al., 1988) y síndrome de Sjörgen (Miyasaka, 1984). Estudios genéticos de ligamiento del todo genoma en familias con EM mostraron una asociación potencial de la región 10p15 con la enfermedad (Akesson et al., 2003). Esta región contiene el gen que codifica para la cadena alpha del receptor de la IL2 (IL2R¿/CD25). Esta asociación fue descrita también para DT1 mediante estudios de ligamiento de genoma completo y como gen candidato mediante la estrategia de Tag-SNP (Vella et al., 2005). Genes de susceptibilidad comunes entre enfermedades de tipo autoinmune Se ha mostrado cierta coincidencia de loci de susceptibilidad entre diferentes enfermedades autoinmunes y también comparando las regiones génicas conservadas implicadas en modelos animales de diferentes enfermedades (Becker et al., 1998). Estas coincidencias apoyan la hipótesis de que en ciertos casos enfermedades autoinmunes clínicamente diferentes puedan estar controladas por un conjunto común de genes. EM muestra varias características comunes con otras enfermedades incluyendo heredabilidad poligénica, susceptibilidad parcial conferida por genes de HLA y evidencias de contribución ambiental. La predisposición genética en algunos pacientes con EM favorece el desarrollo de otras enfermedades autoinmunes como DT1 (Nielsen et al., 2006), enfermedad inflamatoria intestinal (Gupta et al., 2005) o lupus eritomatoso sistémico (LES) (Corporaal et al., 2002). Estos datos sobre factores de riesgo comunes a enfermedades autoinmunes inducen a plantear como genes candidatos a EM aquellos determinados para otras enfermedades. Las citoquinas, por tener un papel esencial en la regulación de la respuesta inmune, son candidatos a participar en la etiologia de enfermedades autoinmunes. De hecho variantes de algunas de ellas y sus receptores se han visto implicadas en varias enfermedades de tipo autoinmune. Las citoquinas proinflamatorias se conocen por jugar un importante papel en la progresión y daño tisular en enfermedades de tipo autoinmune como EM, AR o LES. IL6 se considera como una de más importantes citoquinas proinflamatorias. Polimorfismos en el promotor de la IL6 que afectan la expresión génica fueron asociados con susceptibilidad a AR (Fishman et al., 1998) y DT1 (Jahromi et al., 2000). Además, la IL6 contribuye a diferentes neuropatologías humanas y se ha implicado en la etiología del la EAE en ratones transgénicos para IL6. Ratones knockout para la IL6 mostraron ser altamente resistentes a desarrollar EAE (Okuda et al., 1998). IL6 ejerce una actividad inhibitoria en la diferenciación de Th1 y T reg y en el cambio del balance de Treg a células Th17, sugerido como determinante en la patogénesis de la EAE. Otro de los genes que se ha visto implicado en varias patologías de tipo autoinmune es el FCRL3 que codifica una glicoproteína que es un miembro de la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas. Aunque su función se desconoce, FcRL3 contiene motivos ITAM en su dominio citoplásmico sugiriendo un papel del receptor en regulación inmune (Ravetch & Bolland, 2001). Tratamiento y respuesta a interferón En el tratamiento con base inmunológica de la EM el uso de los IFNs tipo I ha obtenido los resultados más prometedores. Su empleo en pacientes con EM se debió a la hipótesis de que la enfermedad podía estar causada por una infección viral persistente o latente del sistema nervioso central en personas con un sistema inmunitario alterado. Los IFN poseen actividad antiviral, antiproliferativa, inmunomoduladora y hormonal (Weinstock-Guttman, 1995). Sin embargo, a pesar de los buenos resultados de la terapia con IFNb, existe un 30% de pacientes que no experimentan una mejoría con dicho tratamiento. Esta falta de respuesta puede ser causada por factores genéticos entre otros. Entre las proteínas cruciales con actividad antiviral inducidas por IFNs de tipo 1 está la enzima OAS1 de la familia de las 2¿,5¿ adenilato sintetasas involucrada en la respuesta antiviral innata. Dado que las proteínas OAS se expresan de forma constitutiva a bajos niveles pueden actuar no solo como proteínas efectoras sino como receptores en el citoplasma de la célula reconociendo patrones de RNA (PRRs) de doble cadena para la detección de virus dsRNA. El RNA degradado por la RNasa L puede activar otros PRRs citoplásmicos, resultando en la inducción de la expresión IFN de tipo I (Malathi et al., 2007). Esto es un mecanismo de amplificación de la producción de IFN mediante la activación de la ruta de OAS-RNasa L. La importancia directa de la proteína OAS 1 en la respuesta antiviral ha sido puesta de manifiesto por estudios genéticos que muestran que polimorfismos en el sitio aceptor de splicing del gen OAS1 (que da lugar a dos isoformas de la enzima con diferente actividad) correlaciona significativamente con la respuesta antiviral a la fiebre amarilla. Por otra parte, estos polimorfismos se han visto asociados a susceptibilidad a DT1 (Bonnevie-Nielsen et al., 2005). Estudios de Cribado de genoma completo en EM Hasta la fecha se han realizado tres cribados de genoma completo (GWAS, Genome Wide Association Studies) en EM. En el estudio Wellcome TCCC (2007), aunque no es propiamente un estudio de genoma completo, se analizaron 14.500 SNPs no sinónimos. Este estudio fue decepcionante ya que no logró determinar nuevos factores de riesgo para EM y hasta la fecha no se han replicado ninguna de las asociaciones publicadas. Otro de estos estudios lo realizó el consorcio formado por grupos americanos y británicos denominado IMSGC (Internacional Multiple Sclerosis Genetic Consortium) con el apoyo de la WTCCC con chips de 500,000 SNPs (IMSGC, 2007). Se ha estudiado en familias con EM el desequilibrio de transmisión de las variantes y replicación de los mejores asociaciones en un estudio posterior caso-control. El tercer estudio GWAS ha sido realizado por un grupo Norteamericano (Baranzini et al., 2008) analizando más de 550.000 SNPs en un estudio caso-control de caucasianos de origen europeo. Es interesante destacar que no hay una gran coincidencia entre los loci de riesgo detectados en los estudios con la excepción del HLA, IL2R¿ e IL7R¿. Las razones de esta baja réplica de los loci detectados es que los estudios de GWAS por su carácter multiensayo y los bajos odds ratio de estas asociaciones producen un gran número de falsos positivos y requieren poblaciones muy grandes para confirmar o descartar las asociaciones detectadas. Objetivo El objetivo de esta tesis es identificar genes involucrados en la susceptibilidad a padecer EM y en la evolución de la enfermedad con la estrategia de genes candidatos y estudios funcionales con el fin de de revelar los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad. La identificación de los genes implicados en la susceptibilidad a padecer EM permitiría el descubrimiento de marcadores moleculares que tengan aplicación en su diagnóstico así como el planteamiento de posibles nuevas terapias fruto de un mejor conocimiento de los factores genéticos y rutas moleculares involucradas en la enfermedad. Objetivos propuestos 1. Estudio del sistema de IL2/IL2R¿ en relación con la susceptibilidad a EM: - Análisis de asociación del locus 4q27 donde se localiza el gen de la IL2 - Análisis funcional del polimorfismo -330 del promotor de la IL2 asociados al curso de la EM. - Análisis de asociación con EM de polimorfismos del gen IL2R¿ localizados en zonas reguladoras del gen. - Análisis comparativo de los polimorfismos asociados a EM y DT1 y localización de los SNPs causales de estas asociaciones. 2. Estudio en EM de genes asociadas a otras enfermedades de tipo autoinmune: - Análisis de asociación de variantes del gen de la IL6 en EM previamente asociado a AR. - Análisis de asociación de variante del gen FCRL3 en EM previamente asociado a AR, DT1 y LES. 3. Validación de la asociación determinada por estudios GWAS en EM con variantes del gen IL7R¿. 4. Análisis en EM del gen OAS1 de respuesta a interferón respecto a susceptibilidad y respuesta al tratamiento con IFNb. Pacientes y métodos La selección de los genes candidatos en relación a la susceptibilidad a EM se ha realizado combinando diferentes criterios para identificar y dar la prioridad a los genes de susceptibilidad: - Selección basada en localización en regiones previamente determinadas por su asociación a EM en estudios de ligamiento y GWAS. - Selección de acuerdo a criterios funcionales, tanto por haberse demostrado su implicación en EM en estudios de modelos animales como por haberse demostrado su importancia en autoinmunidad. - Selección por haberse visto asociado a susceptibilidad con otras enfermedades autoinmunes. - Selección por tener una función importante en la ruta de señalización de INF tipo I. Las variantes analizadas en esta tesis son variaciones de una sola base (SNPs), polimorfismos que suponen la mayor fuente de variabilidad entre personas. El criterio de selección de estos SNPs dentro de un locus es tener potencial efecto funcional. En este sentido se seleccionaron SNPs que supusieran cambios de aminoácidos, que se localizaran en regiones aceptoras o donadoras de splicing, en regiones UTR (regiones que no se traducen) y zonas promotoras o reguladoras de la expresión. Se emplearon mayoritariamente dos sistemas de genotipado para la determinación de las variantes PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) técnica que radica en el corte diferencial con endonucleasas de restricción de los productos amplificados por PCR y Taqman, este ensayo utiliza la actividad 5 nucleasa de la polimerasa junto con dos sondas TaqMan para discriminar entre los dos alelos de un SNP. Varios ensayos funcionales se realizaron para determinar el efecto de los polimorfismos localizados en el promotor. Estos se realizan mediante un gen reportador, luciferasa, en transfecciones transitorias y medidas de la actividad luciferasa en los extractos celulares. Los ensayos cuantitativos de la expresión de diferentes genes fueron realizados por transcripción reversa del RNA celular y posterior PCR a tiempo real utilizando SYBR Green como fluoroforo. Las muestras de ADN y ARN utilizados en este trabajo proceden de una cohorte de pacientes de EM y controles sanos que a día de hoy cuenta con 800 pacientes de EM no relacionados procedentes de cuatro hospitales de Andalucía (Hospital Clínico San Cecilio de Granada y Hospital Virgen de las Nieves de Granada, Hospital Carlos Haya de Málaga y Hospital Virgen Macarena de Sevilla). Los controles sanos procedentes de bancos de sangre de cuatro provincias de Andalucía (Granada-Almeria, Malaga, Sevilla). RESULTADOS Genes del sistema de IL2/IL2R¿ Se ha dedicado una parte significativa de esta tesis al estudio de papel de los genes de la IL2 y del IL2R¿ en la susceptibilidad a EM. Tras el análisis de varios polimorfismos en la región promotora y codificante del gen de la IL2 respecto a la susceptibilidad a padecer EM en estudios caso-control, determinamos que la variante -330 G (rs2069762) se encontraba sobre-representada en pacientes de EM aunque no alcanzaba significación estadística, sin embargo este alelo se vio asociado a susceptibilidad con la forma secundaria progresiva (SP) de la enfermedad. Esta asociación pudimos confirmarla posteriormente en una cohorte más amplia manteniéndose lo observado en el estudio original. La estratificación de los pacientes por los cursos de la enfermedad, remitente recidivante (RR) y SP, podría aumentar la potencia estadística del estudio debido a una mayor homogeneidad clínica de los pacientes y permitir la determinación de la asociación del polimorfismo -330 G/T respecto a la enfermedad. La transición del curso RR a SP ocurre en aproximadamente 50% de los pacientes RR con un periodo de transición en tiempo variable e impredecible (Tremlett et al., 2008) Se analizaron los efectos del polimorfismo 330G/T sobre la expresión del gen de la IL2 viéndose un efecto alelo especifico sobre la expresión. Los estudios de transfección en células Jurkat con el gen reportador de la luciferasa controlado por las dos variantes del promotor G o T, mostraron que la construcción que portaba el alelo G era dos veces más activa que la portadora de T. Por otra parte, ensayos de cuantificación relativa de la expresión del gen de la IL2 en PBMCs activadas provenientes de diferentes personas mostró una menor expresión de los transcritos provenientes del promotor con la variante G. Estos datos estuvieron en consonancia con los obtenidos tras la cuantificación total de la expresión del gen de la IL2 por PCR a tiempo real, observándose mayores niveles de expresión de IL2 en muestras de individuos con genotipo TT y GT que GG. Esta divergencia encontrada entre los resultados in vitro con ensayos de transfección en células Jurkat e in vivo en PBMC de diferentes individuos sugiere que el polimorfismo -330 del promotor in vivo podría estar modulado por otras variantes de las que se habría aislado en el estudio in vitro al analizar un pequeño fragmento de la región 5-prima del gen. Estos resultados reflejan el complejo mecanismo de regulación de la expresión del gen de la IL2 e indican que la influencia del polimorfismo -330 está modulada por otros elementos. Por otra parte, estas alteraciones de expresión estarían implicadas en la EM dada la asociación de este SNP funcional con la enfermedad. Posteriormente al trabajo mencionado, el locus TENR-IL2-IL21 se vio asociado en GWAS a DT1, enfermedad de Graves, enfermedad celiaca, AR y soriasis (Todd et al., 2007; van Heel et al., 2007; Liu et al., 2008). Nosotros analizamos los polimorfismos que se habían descrito asociados a estas enfermedades en un estudio caso control con nuestra colección de pacientes y controles de EM. No pudimos replicar la asociación para el SNP rs6822844 teniendo una potencia estadística de 94%. Tampoco observamos asociación con EM del SNP rs3136534. Por tanto, nuestros resultados no mostraron mayor influencia del locus TENR-IL2-IL21 en la susceptibilidad a padecer EM, este estudio no podía descartar asociaciones con OR inferiores a 1,15. Se requerirían estudios con una cohorte mayor así como una mayor densidad de marcadores en la región para descartar o confirmar el papel del locus de la IL2 en la EM. La cadena alpha del receptor de la IL2 tiene un papel regulador esencial en la función de la IL2. Nosotros planteamos un estudio con el objeto de analizar la posible implicación del gen IL2R¿ en EM. Para ello analizamos cuatro polimorfismos localizados en regiones reguladoras de la expresión del gen. Encontramos una asociación significativa del alelo T del polimorfismo rs1570538 con susceptibilidad a padecer EM. Este polimorfismo se localiza en la región 3 UTR del gen de la IL2R¿. Este estudio implica por primera vez el IL2R¿ en susceptibilidad a EM. En estudios posteriores GWAS realizados por el IMSGC se confirmo este locus como factor de riesgo a EM (IMSGC, 2007). A pesar de que la asociación del locus con EM es un hecho, se requería la determinación de la variante causal de la asociación para determinar las implicaciones funcionales en la enfermedad. Por esta razón profundizamos en el estudio del locus realizando un mapeo fino analizando 8 SNPs localizados a lo largo del gen y en la parte 5-prima de este. Estas variantes fueron seleccionadas tomando como base un estudio de mapeo fino del locus de la IL2R¿ en relación a DT1 (Lowe et al., 2007), así como el estudio GWAS realizado en EM por IMSGC y nuestro propio estudio. Por otra parte incrementamos la potencia del análisis aumentando el número de muestras a 800 pacientes y un número equivalente de controles sanos. Con este estudio confirmamos la asociación del locus de la IL2R¿ con EM aunque se encontraron diferencias entre las variantes asociadas a diabetes tipo 1 y EM. El polimorfismo más asociado con diabetes (rs41295061) no mostró asociación con EM. Por otra parte, el SNP rs35285258, perteneciente a otro grupo de asociación a DT1 independiente del SNP rs41295061 mostró máxima asociación en EM pero con alelo de riesgo contrario a DT1. Desconocemos si estos polimorfismos tienen algún efecto funcional sobre la expresión del IL2R¿ ya que ninguno de ellos se localiza en regiones reguladoras conocidas del gen. Sin embargo, otros grupos han relacionado el polimorfismo rs35285258 con variaciones en la concentración del IL2-R¿ soluble lo que sugiere que esta variante u otra de la región que se encuentre en desequilibrio de ligamiento con ella podrían modular la expresión del gen (Lowe et al., 2007). Por otra parte, nuestros resultados y obtenidos simultáneamente por otro grupo para DT1 (Maier et al., 2009) sugieren que los efectos de estas variantes en DT1 y EM son contrarios y por tanto con una implicación diferente en los mecanismos inmunopatológicos de la enfermedad. Genes comunes entre diferentes enfermedades de tipo autoinmune La implicación del gen IL6 en susceptibilidad a varias enfermedades de tipo autoinmune y su potencial papel modulador del curso de la enfermedad demostrado en el modelo EAE nos impulsó a investigar variantes del gen de la IL6 en relación a la susceptibilidad a la enfermedad. Previamente a este estudio se había determinado asociación de un SNP funcional en posición -174 del gen de la IL6 con AR juvenil y DT1. Nosotros analizamos este polimorfismo en relación con susceptibilidad a EM no encontrando diferencias en la distribución de los genotipos de la variante -174 IL6 con respecto al grupo enfermos y controles, también estratificando por género o curso de la enfermedad. No obtuvimos ninguna evidencia que sugiera que la variante funcional del promotor de la IL6 tenga un papel en la patología de la EM a diferencia de otras enfermedades autoinmunes. Otro gen que se ha visto implicado en susceptibilidad a varias enfermedades autoinmunes es el FCRL3. Nosotros analizamos en nuestra cohorte de enfermos de EM y controles sanos la implicación en la susceptibilidad a EM de tres polimorfismos que mostraron máxima asociación in distintas poblaciones y enfermedades autoinmunes. Los polimorfismos seleccionados fueron: una variante funcional en el promotor del gen FCRL3 en posición -169 (FCRL3_3 (rs7528684) que altera la unión del factor de transcripción kappa B al promotor y que regula la expresión del gen, una variante en posición -110 (rs11264799) y un polimorfismo en el tercer exon que produce un cambio de aminoácido Asp/Asn. Observamos una asociación del alelo C del polimorfismo -169 C/T FCRL3 con protección a EM. El alelo C esta relacionado con una mayor expresión del gen y es un factor de riesgo para AR, LES y enfermedad tiroidea autoinmune (Kochi et al., 2005; Thabet et al., 2006), mientras que es un factor protectivo en EM. El análisis de haplotipos mostró que el haplotipo portador del alelo C del polimorfismo -169 C/T FCRL3 estaba fuertemente asociado con protección. Sin embargo, no podemos descartar que otra variante dentro del mismo bloque de desequilibro de ligamiento en la región 5-prima del en FCRL3 o el gen FCRL2 que se encuentra adyacente sea el causante de la asociación. Validación de loci asociados a EM por estudios de GWAS Simultáneamente a la realización de esta tesis el consorcio internacional para la esclerosis múltiple (IMSGC) realizo un estudio de cribado de genoma completo con más de 500000 marcadores en cerca de 931 tríos (hijo enfermo, padre y madre sanos). De este estudio se determinaron una serie de loci asociados a EM, algunos como el HLA o el IL2R¿ ya se conocían como factores de riesgo a la EM. Otros loci fueron descritos por primera vez en asociación a la enfermedad. Sin embargo, estas asociaciones determinadas por GWAS deben ser confirmadas en otras poblaciones de enfermos de EM dado que este tipo de estudios produce un gran número de asociaciones espurias por su carácter multiensayo. Uno de estos loci contenía el gen que codifica para el receptor de la IL7 (IL7R¿). En otro estudio independiente se determinó que la variante T244I del gen de IL7R¿ (rs6897932), se asociaba a EM (Gregory et al., 2007). Esta variante parecía alterar el splicing de los transcritos de la IL7R¿ modificando el balance entre dos formas del tránscrito con diferente composición de exones lo que podría dar origen al aumento de una forma soluble del receptor en detrimento de la forma unida a la membrana. Nosotros decidimos analizar esta variante en nuestra cohorte de pacientes y controles de EM con el objeto de confirmar o descartar la asociación con la enfermedad. Nuestros datos mostraron una mayor representación del alelo C de la variante rs6897932 en casos respecto a controles en consonancia con los datos publicados para otras poblaciones sugiriendo una implicación del gen de la IL7 en la EM. De hecho la IL7 juega un papel fundamental en la supervivencia, diferenciación y proliferación de las células T lo que la sitúa como una molécula clave en el control de la autoinmunidad. Genes de la ruta del interferón respecto a la susceptibilidad a EM y respuesta al tratamiento Uno de los tratamientos con más éxito en la actualidad para la EM es el IFNb. Sin embargo, hay una gran diversidad por parte de los pacientes con respecto a la respuesta a este tratamiento. En la actualidad se desconoce la causa de esta falta de respuesta aunque los factores genéticos podrían tener un papel fundamental. Por otra parte, nuestro grupo, en varios trabajos, ha demostrado que algunos genes de respuesta a IFN tipo I están implicados en la susceptibilidad a EM. En esta tesis nos propusimos estudiar la influencia de variantes del gen OAS1 (2',5'- oligoadenylate synthetase 1) respecto a la susceptibilidad a EM así como respuesta al tratamiento. Se analizaron SNP situados en el aceptor de splicing del exon 7 (rs10774671) y un SNP no sinónimo (Ser162Gly) (rs3741981), situado en el exon 3. Nosotros encontramos que el haplotipo GA creado por el alelo G en la variante rs10774671 y el alelo A de rs3741981 es 4.6 veces mas frecuente en enfermos de EM respecto controles sanos. No se encontró ninguna asociación ni de alelos, genotipos o haplotipos de estos marcadores respecto a la respuesta al tratamiento. Estos resultados conjuntamente con otros que muestran asociación de variantes de genes de respuesta a IFN tipo I como Interferon regulatory factor 5 (IRF5) (Kristjansdottir et al., 2008) o de las cadenas del receptor evidencian la implicación de esta ruta en susceptibilidad a EM (Leyva et al., 2005). Dada la función antivírica de la ruta del interferón es tentativo sugerir que su implicación en la EM podría estar relacionada con la susceptibilidad a ciertas infecciones víricas relacionadas con la patogenía. CONCLUSIONES 1. El polimorfismo -330 del promotor del gen de la IL2 se asocia con susceptibilidad a la forma secundaria progresiva de la EM. Este polimorfismo modifica los niveles de expresión alélica y su efecto es modulado por otros elementos reguladores in vivo. La expresión de la IL2 se ve alterada en pacientes de EM lo que sustenta la importancia de esta citoquina en la enfermedad. 2. Los polimorfismos -475 y -631 del promotor del gen de la IL2 no contribuyen a la susceptibilidad a EM. 3. Nuestros resultados descartan una importante influencia de las variantes del locus TENR-IL2-IL21 asociadas con DT1, AR y enfermedad celiaca aunque este locus parece tener un papel en progresión de la enfermedad. 4. Se ha determinado por primera vez la asociación de locus del IL2R¿ con susceptibilidad a padecer EM. El análisis de polimorfismos en este locus reveló una heterogeneidad entre EM y DT1 con respecto a la asociación genética sugiriendo una implicación diferente de esta ruta en la inmunopatología de estas enfermedades. 5. No se encontraron evidencias de que la variante del promotor del gen de la IL6 asociada a otras enfermedades autoinmunes sea un factor de riesgo para la EM. 6. La variante funcional -169C del promotor del gen FCRL3 determinada como factor de riesgo para varias enfermedades autoinmunes es un factor de protección para EM. 7. La variante funcional rs6897932 C del IL7R¿ se confirma como factor de riesgo a EM en la población española. 8. Haplotipos pero no variantes independientes revelaron una asociación respecto EM del gen OAS1 involucrado en respuesta innata antivírica. Estos datos apoyan la implicación de la ruta del IFN tipo 1 en EM y sugieren que la asociación de OAS1 con la enfermedad podría deberse a su papel antivírico.