Role of sigma-1 receptors in capsaicin-induced mechanical hypersensitivitystudies with sigma-1 ligands, knockout mice and antisense oligodeoxynucliotides

Laburpena

ANTECEDENTES, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS La existencia de los denominados receptores sigma fue propuesta por Martin y colaboradores en 1976. Inicialmente, fueron considerados un subtipo de receptor opiode y más tarde fueron confundidos con el sitio de unión de la fenciclidina en el receptor de NMDA (N-metil-D-aspartato). Hoy en día, los receptores sigma son considerados como una entidad farmacológica independiente (revisado por Guitart et al., 2004; Monnet y Maurice, 2006), en la que se han caracterizado farmacológicamente dos subtipos, denominados sigma1 y sigma2 (revisado por Matsumoto et al., 2003; Cobos et al., 2008a). El receptor sigma1 ha sido clonado en humanos y roedores, incluyendo ratones (Hanner et al., 1996; Prasad et al., 1998; Pan et al., 1998), y no muestra homología con ninguna otra proteína de mamíferos (Guitart et al., 2004; Monnet y Maurice, 2006), mientras que el receptor sigma2 no ha sido clonado todavía. Actualmente, la farmacología del receptor sigma1 está bien caracterizada, y hay disponibles agonistas selectivos, como (+)-pentazocina y PRE-084, y antagonistas selectivos, como BD-1063, BD-1047 y NE-100 (Guitart et al., 2004; Hayashi y Su, 2004; Cobos et al., 2008a). Algunos neuroesteroides, psicoestimulantes y antipsicóticos también se unen a los receptores sigma1 (Maurice et al., 2001; Monnet y Maurice, 2006). Entre los antipsicóticos, el haloperidol (HP) merece una consideración especial, porque aunque es conocido principalmente como un antagonista del receptor D2, muestra una afinidad equiparable por los receptores sigma1 (Bowen et al., 1990; Matsumoto y Pouw, 2000), sobre los que se comporta como un antagonista (Maurice et al., 2001; Hayashi y Su, 2004). Sus metabolitos, haloperidol metabolito I (HP-Met-I) y II (HP-Met-II), son también antagonistas sigma1 (Cendán et al., 2005a), y muestran una afinidad preferencial por los receptores sigma1 en relación con la que presentan por los receptores D2 (Bowen et al., 1990; Matsumoto y Pouw, 2000). Los receptores sigma-1 están implicados en la nocicepción, entre otros procesos. Se distribuyen en áreas del sistema nervioso central con gran importancia en el control del dolor, tales como las láminas superficiales del asta dorsal de la médula espinal, el locus coeruleus y la médula rostroventral (Alonso et al., 2000; Kitaichi et al., 2000). La potenciación de la antinocicepción opiode por los antagonistas del receptor sigma1 ha sido documentada ampliamente (Chien y Pasternak, 1993; Marrazzo et al., 2006; Mei y Pasternak, 2002 y 2007), aunque los receptores sigma1 también están implicados en la nocicepción en ausencia de opiodes. De hecho, estudios realizados por nosotros y otros grupos de investigación han demostrado que tanto la inactivación genética (en ratones knockout sigma1) como el antagonismo farmacológico de los receptores sigma1, producen efectos antinociceptivos en el test de la formalina (Cendán et al., 2005a y 2005b, Kim et al., 2006). Cabe destacar, que en la segunda fase del dolor inducido por formalina está implicado el fenómeno de sensibilización central, en el cual se produce una fosforilación del receptor de NMDA a nivel espinal, induciéndose así una potenciación de su actividad (Sawynok y Liu, 2004). Este fenómeno de sensibilización central ocurre tanto durante el dolor inflamatorio, como en el dolor neuropático; es iniciado por la estimulación mantenida de los nociceptores periféricos, y resulta en una potenciación de la sensibilidad de las neuronas implicadas en la transmisión del dolor a nivel tanto del asta dorsal de la médula espinal como en el cerebro (Woolf y Salter, 2000, Ji y Woolf, 2001, Ji et al., 2003). El desarrollo y mantenimiento de la sensibilización central depende en gran medida de la activación del receptor de NMDA (Willis et al., 2001; Ji and Woolf, 2001). Los receptores sigma1 juegan un papel importante en la modulación de la actividad del receptor de NMDA (revisado por Debonnell y Montigny, 1996; Cobos et al., 2008a), así como en su fosforilación (Kim et al., 2006 y 2008); además, estudios recientes muestran que los receptores sigma1 pueden incluso modular el dolor agudo inducido por la administración intratecal de NMDA (Kim et al., 2008). Teniendo en cuenta estos antecedentes, la hipótesis principal de está Tesis Doctoral fue que los receptores sigma1 podrían estar implicados en la sensibilización central de las vías del dolor, y que los fármacos que actúan sobre estos receptores podrían inhibir este proceso, pudiendo ser útiles para el tratamiento de ciertos tipos de dolor que impliquen este fenómeno. En particular, nuestro estudio se centra en el papel del receptor sigma1 en uno de los síntomas más característicos de la sensibilización central y del dolor patológico: la sensibilización a un estímulo mecánico (alodinia mecánica). La inyección de capsaicina induce un incremento en la sensibilidad al dolor en el área próxima al sitio de inyección de capsaicina (área de hipersensibilidad mecánica secundaria), que resulta del proceso de sensibilización central (Sang et al., 1996; Baron, 2000). Los cambios en la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina han sido usados como modelo para estudiar las consecuencias comportamentales del tratamiento farmacológico de la sensibilización central (por ejemplo, Park et al., 1995; Baumgärtner et al., 2002; Gottrup et al., 2004; Bingham et al., 2005). Además, la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina se considera un modelo predictor del dolor neuropático, ya que no sólo mimetiza los cambios sensoriales de esta enfermedad (Baumgärtner et al., 2002; Klein et al., 2005), sino que los fármacos antineuropáticos disminuyen la hipersensibilidad mecánica inducida tanto por capsaicina, como por una neuropatía (Gottrup et al., 2004; Joshi et al., 2006; Dworkin et al., 2007; Hagen et al., 2008; Nieto et al., 2008). Sin embargo, no se ha descrito previamente el posible papel de los receptores sigma1 en la sensibilización a estímulos mecánicos inducida por capsaicina. Además, la implicación de estos receptores en el dolor inducido por una estimulación mecánica nociva en animales no sensibilizados tampoco ha sido estudiada con anterioridad. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue determinar si el receptor sigma1 podría ser considerado como una nueva diana farmacológica para el tratamiento de la alodinia mecánica o del dolor nociceptivo mecánico de carácter puntiforme. Para cumplir este objetivo, utilizamos tres herramientas experimentales: ratones deprovistos del receptor sigma1 (knockout sigma1), fármacos antagonistas y agonistas para el receptor sigma1, y oligodesoxinucleótidos antisentido frente al receptor sigma1. La disponibilidad de ratones knockout sigma1 (desarrollados por Langa et al., 2003) ofrece grandes posibilidades para el estudio funcional de estos receptores, por lo que el primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue comparar las características del dolor nociceptivo mecánico y de la alodinia mecánica inducida por capsaicina, en ratones salvajes y knockout para el receptor sigma1. Como ha sido mencionado anteriormente, hay disponible en la actualidad una gran variedad de ligandos para el receptor sigma1. Por lo tanto, el segundo objetivo de esta Tesis Doctoral, fue evaluar si el bloqueo farmacológico del receptor sigma1, tanto por antagonistas selectivos (BD-1063, BD-1047 y NE-100), como por antagonistas no selectivos de este receptor (haloperidol y sus metabolitos), modula la alodinia mecánica y/o el dolor nociceptivo; así como estudiar si la coadministración con un agonista selectivo sigma1 (PRE-084) revierte los efectos de los antagonistas sigma1. La sensibilización central en la médula espinal se acompaña de cambios sustanciales en el procesamiento de la información nociceptiva a nivel cerebral, produciéndose un fenómeno similar al de sensibilización central a nivel supraespinal, que contribuye al incremento de la sensibilidad al dolor (revisado por Porreca et al., 2002; Ji et al., 2003). Estos cambios en la actividad supraespinal relacionados con el dolor han sido documentados ampliamente en el modelo de estimulación mecánica en el área de hipersensibilidad mecánica secundaria inducida por capsaicina (Iadarola et al., 1998; Baron et al., 1999; Iannetti et al., 2005; Zambreanu et al., 2005). Sin embargo, el posible papel modulador de los receptor sigma1 supraespinales en este proceso no ha sido estudiado con anterioridad. Por lo tanto, el tercer objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar los efectos en la alodinia mecánica inducida por capsaicina y en el dolor nociceptivo mecánico (en animales no sensibilizados con capsaicina) de la inhibición supraespinal de los receptores sigma1, inducida por la inyección intracerebroventricular de dos ASOs diferentes para el receptor sigma1. MÉTODOS Animales de experimentación Todos los experimentos fueron realizados en ratones hembra de la cepa CD-1 (Charles River, Barcelona, España) con un peso de 25-30 g. Para obtener los ratones knockout sigma1 de la cepa CD-1, los animales previamente generados por Langa y colaboradores (2003) fueron cruzados durante 10 generaciones con ratones CD-1 puros, asegurando de esta manera una pureza de la cepa CD-1 de al menos un 99% (Wong et al., 2002); los ratones portadores de la mutación fueron posteriormente cruzados hasta obtener individuos knockout homocigotos, los cuales fueron utilizados en el curso de esta Tesis Doctoral. Los ratones fueron manipulados de acuerdo con la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/ECC). El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Universidad de Granada, España. A. Experimentos in vivo Evaluación de la respuesta comportamental frente a la estimulación mecánica. Aspectos generales Los animales fueron colocados individualmente dentro de los compartimentos de evaluación (situados en una plataforma elevada con un suelo de maya metálica) durante dos horas, con el fin de habituarlos a las condiciones de experimentación. Tras este periodo de tiempo, los animales fueron inyectados intraplantarmente (i.pl.) con capsaicina (o su solvente, DMSO 1% en salino fisiológico) en la pata trasera derecha, e inmediatamente devueltos a sus compartimentos. Quince minutos después de la inyección de capsaicina (tiempo de máxima sensibilización) o su solvente, se aplicó el estímulo mecánico puntiforme a través de la maya metálica, utilizando un algesímetro electrónico (Dynamic Plantar Aesthesiometer, Ugo Basile, Varese, Italia). Este aparato utiliza un único filamento rígido (con un diametro de 0.5 mm), que fue dirigido electrónicamente hacia la parte ventral de la pata trasera derecha que previamente había sido inyectada. El filamento fue aplicado a una distancia aproximada de 5 mm desde el lugar de la inyección en dirección hacia los dedos. Cuando el animal retira la pata, el estímulo mecánico cesa automáticamente, quedando registrado el tiempo de latencia de la respuesta. Este tipo de registro nos permite utilizar el tiempo de latencia de retirada de la pata como un indicador de la percepción del dolor en los ratones evaluados. Cada animal fue evaluado tres veces, dejando un intervalo de 0,5 min entre cada una de las estimulaciones, y con un tiempo máximo de estimulación de 50 s (tiempo de corte). Para cuantificar la fuerza necesaria para inducir la retirada de la pata, evaluamos el efecto producido por la aplicación del filamento en un amplio rango de intensidades de estimulación (0,05 a 8 g de fuerza), tanto en animales previamente inyectados con capsaicina (1 µg) como en los inyectados con su solvente (DMSO 1%). Este método nos permitió estudiar la relación entre la intensidad de la estimulación y la respuesta producida en el animal (curva fuerza-respuesta), que permite cuantificar el grado de dolor nociceptivo mecánico para cada intensidad de estimulación (en ratones no sensibilizados), así como valorar, en animales sensibilizados, la hipersensibilidad mecánica inducida por una dosis constante (1 µg) de capsaicina. Además, este tipo de curvas hace posible la comparación entre ambas condiciones experimentales (dolor nociceptivo e hipersensibilidad mecánica) mediante el cálculo del parámetro Fuerza Eficaz 50 (FE50), que se define como la intensidad de estimulación (en g de fuerza) necesaria para producir la mitad de la reducción máxima del tiempo de latencia de retirada de la pata. Para estudiar el efecto de los distintos tratamientos utilizados en esta Tesis Doctoral, usamos dos tipos diferentes de estimulación mecánica. Para evaluar los efectos en la alodinia mecánica utilizamos una estimulación de 0,5 g de fuerza, ya que esta intensidad del estímulo no indujo retirada de la pata en animales tratados con el solvente de la capsaicina (es decir, fue un estímulo inocuo), mientras que redujo marcadamente el tiempo de latencia de retirada de la pata en ratones sensibilizados con capsaicina. Para la evaluación de los efectos de los tratamientos en el dolor mecánico puntiforme, los animales inyectados con DMSO (no sensibilizados) fueron estimulados con el filamento a una intensidad de 4 g de fuerza. Esta intensidad de estimulación produjo una rápida retirada de la pata en animales no sensibilizados (estímulo nocivo), siendo el tiempo de latencia de esta respuesta similar a aquel obtenido en los animales sensibilizados con capsaicina y estimulados a una intensidad de 0,5 g de fuerza. Por consiguiente, tanto una estimulación con 4 g de fuerza en animales no sensibilizados como un estímulo de 0,5 g en animales sensibilizados con capsaicina indujeron respuestas comportamentales equivalentes, de modo que estas aproximaciones nos permitieron comparar los efectos de los distintos tratamientos estudiados en el dolor nociceptivo mecánico y en la alodinia mecánica inducida por capsaicina. Comparación de la alodinia mecánica y del dolor nociceptivo mecánico puntiforme en ratones salvajes y knockout para el receptor sigma1 Para comparar las características del dolor nociceptivo mecánico y de la alodinia mecánica inducida por capsaicina, en ratones salvajes y knockout sigma1 (primer objetivo), utilizamos dos aproximaciones experimentales diferentes. En primer lugar, realizamos una curva fuerza-respuesta (es decir, intensidad de los estímulos vs tiempo de latencia de retirada de la pata) en ratones salvajes y knockout sigma1, previamente inyectados con capsaicina (1 µg) o su solvente (DMSO 1%). Esta aproximación nos permitió comparar la respuesta comportamental de ratones salvajes y ratones knockout sigma1, frente al dolor nociceptivo mecánico y frente a la alodína mecánica. En segundo lugar, los animales fueron inyectados intraplantarmente con diferentes dosis de capsaicina (0,125 a 4 µg) o su solvente, para ser posteriormente estimulados con una intensidad de 0,5 g de fuerza (estímulo no doloroso en condiciones normales). Con esta segunda aproximación pudimos obtener una relación entre la dosis de capsaicina administrada y el grado de alodinia mecánica inducido (disminución del tiempo de latencia de retirada de la pata), tanto en los ratones salvajes como en los ratones knockout sigma1. Evaluación de los efectos de los fármacos en la alodínia mecánica y en el dolor nociceptivo mecánico Para cumplir el segundo objetivo de esta Tesis Doctoral, evaluamos los efectos de varios ligandos sigma1, tanto en la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina como en el dolor nociceptivo mecánico puntiforme, y comparamos sus efectos con aquellos producidos por varios fármacos control. Para ello, usamos tanto antagonistas selectivos para el receptor sigma1 (BD-1063, BD-1047 y NE-100) como no selectivos (HP y sus metabolitos I, II y III) (Hayashi and Su, 2004; Guitart et al., 2004; Cobos et al., 2008a). Además, con el fin de controlar la influencia del antagonismo dopaminérgico en los efectos inducidos por el haloperidol y sus metabolitos, evaluamos el efecto del (-)-sulpiride, un antagonista de los receptores D2/D3 que carece de afinidad por los receptores sigma1 (Freedman et al., 1994; Matsumoto and Pouw, 2000). Igualmente, comparamos los efectos producidos por los ligandos sigma1 con los ejercidos por fármacos con actividad antialodínica previamente descrita (gabapentina, pregabalina y tetrodotoxina) (Dworkin et al., 2007; Hagen et al., 2008; Nieto et al., 2008). Como control de fármacos activos frente a la alodinia mecánica y el dolor nociceptivo, usamos mexiletina y clonidina (Khandwala et al., 1997; Paqueron et al., 2003). Como control negativo utilizamos rofecoxib, un fármaco antiinflamatorio (Moore et al., 2005), que carece tanto de actividad antinociceptiva como antialodínica en animales sin inflamación (Bingham et al., 2005; Padi y Kulkarni, 2004). Con el objetivo de identificar la posible implicación de los receptores sigma1 en los efectos inducidos por los fármacos anteriormente mencionados, evaluamos los efectos del agonista selectivo sigma1 PRE-084 (Su et al., 1991) per se en la alodinia mecánica y en el dolor nociceptivo mecánico, así como si este fármaco podría revertir los efectos de los antagonistas sigma1 y de los fármacos antineuropáticos evaluados. Para estudiar los efectos de estos fármacos, los animales fueron inyectados subcutáneamente (s.c.) con las soluciones de los fármacos (o su solvente) en la región interescapular en un volumen de 5 ml/kg; 45 minutos después (es decir, 15 minutos después de la administración de capsaicina o su solvente), evaluamos la alodinia mecánica o el dolor nociceptivo mecánico (como se describe anteriormente). Cuando utilizamos PRE-084 para revertir los efectos de los fármacos evaluados, la solución de PRE-084 fue inyectada (via s.c.) inmediatamente antes de la otra solución. Cada inyección fue realizada en áreas corporales diferentes para evitar la mezcla de las soluciones de los fármacos, evitando así cualquier interacción fisicoquímica entre ellas que pudiera interferir con los resultados. Evaluación de los efectos de la inhibición supraespinal de los receptores sigma1 en la alodinia mecánica y en el dolor nociceptivo mecánico Para evaluar los efectos en la alodinia mecánica inducida por capsaicina y en el dolor nociceptivo mecánico, de la inhibición de los receptores sigma1 localizados supraespinalmente (tercer objetivo), los animales fueron tratados intracerebroventricularmente (i.c.v.), durante 4 dias consecutivos, con dos oligodesoxinucleótidos antisentido (ASOs) fosfotiolados diferentes, aunque ambos dirigidos frente a la secuencia de ADNc del receptor sigma1 de ratón. Estos ASOs fueron diseñados para hibridar con áreas diferentes del ARNm diana. El ASO-A hibridaría con una secuencia posterior a la del codón de inicio (desde +77 a +97) (King et al., 1997; Pan et al., 1998); mientras que el ASO-B fue diseñado para hibridar con la secuencia que contiene al codón de inicio (desde -11 a +9) (Ueda et al., 2001). Para comprobar la especificidad de los efectos inducidos por ambos ASOs, los animales fueron inyectados i.c.v. con dos oligodesoxinucleótidos fosfotiolados control (COs). Como control del ASO-A se intercambiaron tres pares de bases dentro de su secuencia, para generar el CO-A (King et al., 1997; Pan et al., 1998). Como control del ASO-B, su secuencia fue aleatorizada, para obtener el CO-B. Esta secuencia no mostró ninguna complementariedad con otra secuencia de ADNc registrada en la Base de Datos GenBank (NIH, Bethesda, MD, USA). La evaluación de la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina y del dolor nociceptivo mecánico puntiforme fue realizada cinco y once días tras la primera administración de los ASOs sigma1, COs o su solvente (es decir, 24 horas y una semana después de la finalización de los tratamientos), utilizando el protocolo descrito en apartados anteriores. B. Experimentos in vitro Ensayos de fijación de [3H](+)-pentazocina Para estudiar los receptores sigma1 en fracción sinaptosomal cruda (fracción P2) de cerebro completo de ratón (obtenida siguiendo el protocolo descrito por González y cols., 2001), realizamos ensayos de fijación de radioligando, marcando los receptores sigma1 con [3H](+)-pentazocina (un radioligando selectivo del receptor sigma1). Para estudiar el número de receptores sigma1 en ratones salvajes y knockout sigma1, realizamos ensayos de saturación de radioligando. Para estudiar la afinidad por los receptores sigma1 de cerebro de ratón de los fármacos evaluados en los ensayos in vivo, se realizaron ensayos de competición de radioligando. Estos ensayos de fijación fueron realizados usando los protocolos previamente descritos (Cobos et al., 2007), levemente modificados. Brevemente, las suspensiones de membranas cerebrales (en una concentración final de proteína de 1 mg/ml) fueron incubadas con [3H](+)-pentazocina (a una concentración final de 5 nM en los ensayos de competición y de 0,1 a 37 nM en los experimentos de saturación) y con el fármaco frío o su solvente, a 30 ºC, pH 8, durante 240 minutos. La fijación no específica fue definida como la fijación retenida en presencia de 10 sigmaM de HP. La reacción se detuvo con 5 ml de Tris 10 mM pH 7,4 enfriado en hielo, y el radioligando unido fue separado del libre mediante filtración (Brandel cell harvester; Brandel Instruments, SEMAT Technical Ltd., UK). Los filtrados de las muestras se realizaron a través de filtros de fibra de vidrio (Whatman GF/B), previamente humedecidos con una solución de polietilenimina al 5% durante al menos una hora. Posteriormente la radioactividad contenida en los filtros se midió en un contador de centelleo líquido (Beckman Coulter España S.A). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Comparación de la alodinia mecánica y del dolor mecánico puntiforme en ratones salvajes y knockout para el receptor sigma1 Para comparar el grado de alodinia mecánica y de dolor mecánico puntiforme en ratones salvajes y knockout sigma1, los animales fueron tratados i.pl. con 1 sigmag de capsaicina o su solvente (DMSO 1%). Posteriormente, se les aplicó el filamento a diferentes intensidades de estimulación (que variaron desde estimulaciones inocuas a nocivas), con objeto de construir una curva fuerza-respuesta (ver Métodos para más detalles). La mutación en los ratones knockout sigma1 fue confirmada mediante ensayos de fijación de [3H](+)-pentazocina. A medida que la fuerza del estímulo mecánico aplicado en la pata fue aumentando, el tiempo de latencia para la retirada de la pata fue disminuyendo, de modo similar en los ratones salvajes y en los knockout sigma1. Esto sugiere que la mutación en los ratones knockout para el receptor sigma1 no afectó a la percepción del estímulo mecánico. La inyección de capsaicina en los animales salvajes indujo una disminución de la FE50 de 9,4 veces, en comparación con los ratones salvajes tratados con el solvente de la capsaicina (DMSO 1%). En cambio, la curva fuerza-respuesta para los ratones knockout sigma1 tratados con 1 sigmag de capsaicina, fue equivalente a la de los animales knockout tratados con DMSO. Por lo tanto, la inyección de capsaicina indujo hipersensibilidad mecánica en los ratones salvajes, pero no en los knockout para el receptor sigma1. También comparamos los efectos de diferentes dosis de capsaicina en los ratones salvajes y en los knockout sigma1, evaluando el tiempo de latencia de retirada de la pata tras la estimulación con el filamento a una intensidad inocua (0,5 g de fuerza). Cuando los ratones salvajes fueron inyectados con capsaicina (0,125 a 4 µg), el tiempo de latencia de retirada de la pata se redujo marcadamente y de manera dosis-dependiente (es decir, se indujo alodinia mecánica). Esta alodinia mecánica fue máxima tras la administración de 1 y 2 µg de capsaicina. Sin embargo, bajo las mismas condiciones experimentales, los ratones knockout sigma1 mostraron sólo una modesta reducción del tiempo de latencia de retirada de la pata inyectada con capsaicina. En resumen, encontramos que los ratones knockout sigma1 no fueron capaces de ser sensibilizados por capsaicina. Sin embargo, la inactivación genética de los receptores sigma1 no afectó ni a la percepción del estímulo mecánico, ni a la respuesta motora necesaria para la retirada de la pata (ya que los animales salvajes y los knockout sigma1, no sensibilizados, mostraron respuestas equivalentes). Además, bajo nuestras condiciones experimentales, los ratones salvajes fueron sensibilizados al estímulo mecánico puntiforme tras la administración de capsaicina, como se había descrito previamente (Gilchrist et al., 1996; Joshi et al., 2006), por lo que nuestros resultados no pueden ser justificados por algún tipo de limitación metodológica. Efectos de los fármacos en la alodinia mecánica inducida por capsaicina y en el dolor nociceptivo mecánico puntiforme, en ratones salvajes La administración subcutánea tanto de los antagonistas selectivos sigma1 (BD-1063, BD-1047 y NE-100), como de los antagonistas no selectivos (HP, HP-Met-I y HP-Met-II), indujo un efecto antialodínico de manera dosis dependiente; es decir, los antagonistas sigma1 evaluados incrementaron el tiempo de latencia de retirada de la pata inyectada con capsaicina, cuando fue estimulada con el filamento a una intensidad de 0,5 g de fuerza. Los ensayos de competición con el radioligando mostraron que todos estos fármacos desplazaron a la [3H](+)-pentazocina de su sitio específico de fijación en membranas de cerebro de ratón, lo que demuestra que tienen afinidad por el receptor sigma1. Cabe destacar que tanto (-)-sulpiride (usado como control de antagonista dopaminérgico), como un metabolito adicional del HP, el HP-Met-III, carecieron tanto de actividad antialodínica como de afinidad por los receptores sigma1, según mostraron los ensayos de fijación de radioligando realizados. Cuando coadministramos los antagonistas del receptor sigma1 con el agonista selectivo sigma1 PRE-084, encontramos que este compuesto, a dosis que no modificaron el tiempo de latencia de retirada de la pata en animales tratados con capsaicina, previniendo el efecto antialodínico inducido por todos los antagonistas sigma1 evaluados. Estos resultados indican que los antagonistas sigma1 evaluados (tanto los selectivos como los no selectivos), inhibieron la sensibilización inducida por capsaicina a través del bloqueo del receptor sigma1. También estudiamos los efectos de los antagonistas sigma1 en el dolor nociceptivo mecánico de carácter puntiforme. Cuando administramos estos fármacos a las mismas dosis que produjeron un efecto antialodínico máximo, no se produjo incremento alguno en la latencia de retirada de la pata de los ratones no sensibilizados (tratados con DMSO 1%), y estimulados con un estímulo nocivo puntiforme (filamento con una intensidad de 4 g de fuerza); es decir, estos fármacos no ejercieron ningún efecto antinociceptivo. Es destacable que tanto, la actividad antialodínica de los antagonistas sigma1, como su ausencia de efecto contra el dolor nociceptivo, están en concordancia con los resultados obtenidos en los ratones knockout sigma1. Así mismo, se comparó la actividad de los antagonitas sigma1 evaluados con la de varios fármacos controles. En primer lugar, estudiamos la afinidad de estos fármacos control por los receptores sigma1, encontrando que todos estos fármacos control carecieron de afinidad por estos receptores. Los efectos antialodínicos y antinociceptivos de los fármacos controles fueron evaluados con la misma metodología que fue utilizada para evaluar los efectos de los antagonistas sigma1. Observamos que pregabalina, gabapentina y tetrodotoxina fueron capaces de inhibir la alodinia mecánica inducida por capsaicina, sin ejercer ningún efecto antinociceptivo frente al dolor mecánico puntiforme. Estos resultados eran esperables, ya que estudios previos describieron que estos fármacos inhibían la alodinia mecánica en modelos de dolor neuropático (Joshi et al., 2006; Han et al., 2007; Nieto et al., 2008), a dosis que no ejercieron efectos antinociceptivos en los animales control (Fields et al., 1997; Joshi et al., 2006; Nieto et al., 2008). Por otro lado, mexiletina y clonidina mostraron efectos tanto antialodínicos como antinociceptivos. Estos datos también concuerdan con los resultados previamente descritos para estos dos fármacos (Khandwala et al., 1997; Honda et al., 2002; Paqueron et al., 2003). Por otra parte, el rofecoxib (utilizado como control negativo) careció tanto de actividad contra la alodinia mecánica como contra el dolor nociceptivo mecánico puntiforme, lo cual también es congruente con los datos previamente descritos acerca de la ausencia de efecto de este fármaco en la hipersensibilidad mecánica inducida por una neuropatía o por la administración de capsaicina (Padi y Kulkarni, 2004; Bingham et al., 2005). Estos resultados obtenidos con los fármacos control, indican que la metodología usada en esta Tesis Doctoral es adecuada y fiable para estudiar la alodinia mecánica y el dolor nociceptivo, y además ayudan a validar los resultados obtenidos con los antagonistas del receptor sigma1. También cabe destacar que los efectos antialodínicos de pregabalina, mexiletina o tetrodotoxina no pudieron ser revertidos con la coadministración de PRE-084. Estos reultados evidencian que el bloqueo del receptor sigma1 podría ser una nueva diana farmacológica contra la hipersensibilidad mecánica, que no es compartida por otros fármacos antineuropáticos conocidos. Efectos de la administración intracerebroventricular de oligodesoxinucleótidos antisentido del receptor sigma1 en la alodinia mecánica inducida por capsaicina y en el dolor nociceptivo en ratones salvajes El tratamiento durante cuatro días consecutivos con ASO-A y ASO-B, inhibió de modo dosis-dependiente la alodinia mecánica inducida por capsaicina (es decir, incrementó de manera dosis-dependiente el tiempo de latencia de retirada de la pata inyectada con capsaicina, al ser estimulada con el filamento a una intensidad de 0,5 g de fuerza), cuando los animales fueron evaluados 24 h tras la última administración de los ASOs en estudio. Este efecto inducido por los ASOs desapareció completamente cuando evaluamos a los animales una semana después de la última inyección i.c.v. Por lo tanto, ninguno de estos ASOs indujo un cambio permanente de la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina. Por otro lado, ni el ASO-A ni el ASO-B exhibieron ningún efecto antinociceptivo contra un estímulo mecánico nocivo puntiforme (4 g de fuerza). Como era esperable, la administración repetida por vía i.c.v. de los CO-A y CO-B (usados como controles de ASO-A y ASO-B, respectivamente), o del salino (solvente de los oligodesoxinucleótidos), no ejerció ningún efecto en la alodinia mecánica o en el dolor nociceptivo, a ninguno de los tiempos evaluados. Estos datos refuerzan la especificidad de los efectos antialodínicos inducidos por la inhibición del receptor sigma1 por los ASOs, e indican que el procedimiento de administración i.c.v. no produjo ninguna alteración cerebral capaz de modificar la respuesta al estímulo mecánico en las diferentes condiciones experimentales. Estos hallazgos sugieren que los receptores sigma1 participan en las modificaciones que ocurren en el procesamiento de la información dolorosa que ocurren a nivel supraespinal tras la sensibilización con capsaicina, sin interferir en los mecanismos fisiológicos cerebrales implicados en el dolor nociceptivo mecánico. CONCLUSIONES Conclusiones específicas 1. La inactivación genética de los receptores sigma1 (en ratones knockout sigma1) inhibió completamente la hipersensibilidad mecánica inducida por la capsaicina en el ratón. 2. El bloqueo farmacológico de los receptores sigma1, mediante antagonistas tanto selectivos como no selectivos, indujo efectos antialodínicos de manera dosis-dependiente. Estos efectos fueron revertidos con el agonista selectivo sigma1 PRE-084. 3. La inhibición supraespinal de los receptores sigma1 inducida por oligodesoxinucleótidos antisentido frente al receptor sigma1 (inyectados i.c.v.), inhibió la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina. Este efecto fue transitorio, desapareciendo completamente en el plazo de una semana tras la última administración. 4. La inactivación genética de los receptores sigma1, el antagonismo farmacológico, o la inhibición supraespinal de estos receptores por oligodesoxinucleótidos antisentido, no interfirió con la percepción del dolor nociceptivo mecánico. Conclusión general Los receptores sigma1 juegan un papel importante en los mecanismos implicados en la hipersensibilidad mecánica inducida por capsaicina (pero no en el dolor nociceptivo mecánico). Por consiguiente, el bloqueo de los receptores sigma1 podría ser una nueva diana farmacológica para el tratamiento de la alodinia mecánica.