Análisis del perfil de expresión génica en respuesta a la quimioterapia y su relación con el estrés oxidativo en el cáncer de mama

  1. Vera Ramírez, Laura
Supervised by:
  1. José Antonio Lorente Acosta Director
  2. Pedro Sánchez Rovira Director
  3. José Luis Quiles Morales Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 06 February 2009

Committee:
  1. María del Carmen Ramírez Tortosa Chair
  2. J. C. Álvarez Secretary
  3. Álvaro Rodríguez Lescure Committee member
  4. César Luis Ramírez Tortosa Committee member
  5. Juan Carlos Rodriguez Manzaneque Escribano Committee member
Department:
  1. MEDICINA LEGAL, TOXICOLOGÍA Y ANTROPOLOGÍA FÍSICA

Type: Thesis

Teseo: 195682 DIALNET

Abstract

Introducción. El cáncer de mama es la neoplasia más frecuente y la primera causa de muerte por cáncer entre las mujeres de todo el mundo. Las tasas de incidencia de esta enfermedad muestran una marcada variabilidad geográfica, siendo máxima en países industrializados, lo que sugiere que el estilo de vida es un factor de riesgo de elevada influencia. Además de los factores de riesgo ambientales, factores de riesgo endógenos, como la edad, la raza, la historia ginecológica, la historia familiar o el patrón mamográfico, determinan individualmente el riesgo de desarrollar una neoplasia mamaria. El cáncer es el resultado de la proliferación no controlada de un grupo de células que, posteriormente y como estrategia de supervivencia, adquieren cierta capacidad invasiva que les permite migrar y colonizar otros tejidos y órganos. El origen de estos eventos proliferativos es conocido como oncogénesis y se divide en tres etapas principales denominadas iniciación, promoción y progresión. A lo largo de estas tres etapas se producen una serie de aberraciones cromosómicas y alteraciones génicas, que dan lugar a una lesión en el tejido mamario que crece exponencialmente con respecto al tiempo hasta alcanzar un volumen tal, que la tasa de crecimiento es estabilizada. El mecanismo biológico que origina el enlentecimiento en el crecimiento del tumor, se basa en la incapacidad de la vascularización pre-existente para satisfacer la demanda de oxígeno y nutrientes de las células neoplásicas en intensivo crecimiento. Consecuentemente, el microambiente tumoral se caracteriza por un marcado estrés oxidativo, fruto de la hipoxia y la elevada tasa de crecimiento celular, que contribuye a la transformación y evolución de la enfermedad. Además, es necesario señalar que existen fuentes exógenas de radicales libres, entre las que destaca el tratamiento con citostáticos, que podrían influir en la progresión de la enfermedad y el resultado clínico de la paciente en tratamiento. El estrés oxidativo define una situación fisiológica producto del desequilibrio entre la actividad de los sistemas de defensa antioxidante y producción de radicales libres, a favor de estos últimos. Por su avidez para aceptar electrones de otras moléculas, los radicales libres pueden modificar la estructura y/o la función de éstas, actuando sobre componentes estructurales como la membrana plasmática y sobre procesos críticos intracelulares, entre los que se incluyen la maquinaria genética y diversos procesos enzimáticos. De este modo, los radicales libres intervienen durante todo el proceso oncogénico e igualmente favorecen la dispersión y migración celular, pues modifican la expresión y/o actividad de genes que codifican proteínas implicadas en el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis. Tras la publicación de los resultados del Proyecto Genoma Humano, hemos asistido a una verdadera revolución tecnológica que ha permitido el desarrollo de herramientas de análisis de alto rendimiento como los microarrays de ADNc, microarrays de oligonucleótidos y la RT-PCR múltiple. Estas tecnologías han sido aplicadas en los últimos años al estudio del cáncer de mama, dando lugar a trabajos que originaron una taxonomía molecular de las neoplasias mamarias con implicaciones terapéuticas y a la identificación de un grupo selecto de genes o firma genómica, con capacidad para predecir la respuesta al tratamiento sistémico del cáncer de mama o el pronóstico de la enfermedad. El empleo de estas tecnologías es adecuado para la identificación de nuevas dianas terapéuticas, especialmente útiles en aquellos casos de pobre pronóstico y en los que una respuesta satisfactoria al tratamiento es improbable. Objetivos. El objetivo general de este trabajo fue identificar aquellos genes cuya expresión es modulada por el tratamiento con quimioterapia y su relación con el estrés oxidativo, para investigar los mecanismos moleculares de respuesta a fármacos antineoplásicos, las principales rutas de transducción de señales intracelulares implicadas en los mismos y como se encuentran influenciados por el aumento en la concentración de radicales libres. Material y Métodos. El diseño experimental de este estudio comprende un total de 93 pacientes distribuidas en tres grupos experimentales definidos por la secuencia en que se administró el tratamiento: neoadyuvancia (NEO) (33 pacientes), adyuvancia (ADY) (30 pacientes) y metástasis (MET) (30 pacientes). Se analizadon marcadores de daño oxidativo, defensa antioxidante y la actividad de enzimas reparadoras del ADN, datos clínicos, y marcadores bioquímicos en los tres grupos. El análisis genómico y la caracterización anatomopatológica de las muestras de tejido fue llevado a cabo en el grupo N exclusivamente. Todos los análisis fueron llevados a cabo en muestras pareadas, es decir, de una misma paciente se extrajeron una muestra previas y otra posterior al tratamiento con quimioterapia. Para la evaluación del daño oxidativo en ADN se empleó el ensayo comet alcalino en linfocitos de sangre periférica, para la evaluación del daño en proteínas se analizó el contenido de proteínas carbonilo en plasma y para la del daño en lípidos se llevó a cabo la cuantificación de TBARS en muestras de plasma. Por otra parte se determinó la capacidad antioxidante total del plasma mediante el ensayo con el radical ABTS¿+, la actividad de enzimas reparadoras del ADN y se extrajeron y cuantificaron una serie de antioxidantes liposolubles (retinol, tocoferol y coenzima Q). Para el tratamiento estadístico de los datos obtenidos del estudio del balance oxidativo y el análisis de la información clínica, se aplicaron tests estadísticos paramétricos y no paramétricos en función de la homogeneidad de la varianza y la normalidad de las variables. Las muestras de tejido empleadas para el análisis genómico fueron seleccionadas en función del contenido de células tumorales y parámetros morfológicos. Posteriormente se extrajo el ARN del tejido, cuya concentración y pureza fueron medidas de forma previa a la síntesis de ADNc. A partir del ADNc se sintetizó el ARNc biotinilado, que fue fragmentado para preparar las mezclas de hibridación que se aplicaron sobre los chips. Por último se procedió al lavado, tinción y escaneado de los chips. El procesamiento bionformático de los datos analizó los controles de calidad necesarios para estimar la validez de los resultados, llevó a cabo un proceso de normalización para eliminar la variabilidad de los datos y aplicó una serie de test estadísticos y herramientas bioinformáticas, como el análisis de PCA y clúster jerárquico, para la obtención de diferencias de expresión génica entre las muestras. Para finalizar, se llevo a cabo el análisis funcional de los genes seleccionados mediante el empleo de los programas PANTHER y DAVID. Resultados y Discusión. En general, los resultados del análisis de marcadores de daño oxidativo mostraron que las pacientes del grupo de neoadyuvancia fueron aquellas que registraron un aumento significativo del daño oxidativo tras la quimioterapia, mientras los grupos de adyuvancia y metástasis mantuvieron niveles de daño elevados pero estables tras el tratamiento. Estos resultados sugieren que, en nuestras condiciones experimentales, la cirugía e intervenciones clínicas previas generan cierto estrés oxidativo al que se suma el provocado por la administración de quimioterápicos, hasta alcanzar un nivel a partir del cual, subsiguientes intervenciones clínicas no generan ningún aumento del daño oxidativo. La activación de los mecanismos de reparación del ADN y defensa antioxidante en los grupos de adyuvancia y metástasis, contribuirían a la estabilización del daño oxidativo observada. El análisis de enriquecimiento funcional destacó 3 rutas moleculares moduladas por el estrés oxidativo: respuesta al estrés oxidativo, angiogénesis, señalización mediada por PDGF y metabolismo de la matriz extracelular. Los resultados de nuestro estudio mostraron que la quimioterapia reprime la expresión de genes que afectan notablemente a la supervivencia, la capacidad invasiva y la migración de células transformadas. Gran parte de estos genes se relacionan directa o indirectamente con los factores de crecimiento PDGF y VEGF, lo que confirma la conocida interrelación entre la remodelación de la matriz extracelular y la angiogénesis como mecanismo promotor de la metástasis. Sin embargo, los radicales libres generados podrían crear un ambiente altamente oxidativo que contrarrestase la quiescencia estromal inducida por la quimioterapia, pues es conocido que estimulan la actividad de los factores de crecimiento pro-angiogénicos y otras moléculas, que a su vez incrementan la producción de radicales libres, creando un bucle de regulación positiva que podría disminuir la eficacia del tratamiento antineoplásico. Por último, se halló un conjunto de genes implicados en la transducción de señales intracelulares propias de un tipo celular altamente indiferenciado y conocido como células madre del cáncer. La represión de la expresión de genes que codifican proteínas activas en puntos alejados del inicio de las cascadas de señalización propias de las células madre, sugieren la presencia de estas células en los tumores de nuestras pacientes e indicaría la limitada eficacia del tratamiento con citostáticos para eliminarlas, ya que muchos de los genes descritos en este trabajo son expresados por tipos celulares característicos del estroma tumoral, posiblemente tras la inducción de las células madre tumorales. La trascendencia clínica de estos resultados radica en que proporcionan un mejor conocimiento de la biología molecular de los tumores en respuesta a la quimioterapia, lo que haría posible el desarrollo de nuevas terapias dirigidas o la mejora de las existentes. Esta intervención, junto con el desarrollo de terapias que reduzcan el estrés oxidativo por debajo del umbral que estimula la inestabilidad genómica de las células tumorales y la activación de señales de crecimiento, mejoraría el resultado clínico y limitaría la toxicidad asociada al mismo. Por otra parte, el desarrollo de fármacos capaces de bloquear la actividad de proteínas implicadas en las cascadas de señalización selectivamente activadas en las células madre tumorales, suponen una prometedora alternativa terapéutica, sobre todo en el caso de carcinomas mamarios altamente indiferenciados y clínicamente agresivos. Conclusión general. El análisis del perfil transcripcional de muestras de cáncer de mama previas y posteriores al tratamiento con antraciclinas y taxanos, mostró la represión de la expresión de un grupo de genes relacionados con la respuesta al estrés oxidativo, la remodelación de la matriz extracelular y la angiogénesis, cuya actividad es modulada positivamente por el aumento del estrés oxidativo inherente al tumor o bien secundario a la quimioterapia. Por otra parte, la quimioterapia promueve la destrucción de células epiteliales, estromales y vasculares cuyo programa transcripcional podría hallarse inducido por las células madre tumorales. Estos hallazgos podrían dirigir el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas o la mejora del tratamiento sistémico existente, aumentando su efectividad y disminuyendo su morbilidad.