Mecanismos moleculares implicados en el tratamiento del cáncer de mamaterapia combinada de citostáticos y compuestos minoritarios del aceite de oliva virgen

Resumen

Antecedentes bibliográficos: El cáncer de mama es una enfermedad con una etiología variada y una enorme cantidad de factores de riesgo como la dieta, hormonas, ambientales, etc. La incidencia mundial sigue creciendo, aunque la mortalidad y morbilidad ha disminuido en los últimos años debido a la detección precoz y mejoras en las pautas de tratamiento. La adriamicina continúa siendo uno de los fármacos más usados y eficaces en esta patología, de hecho está presente en la mayoría de los regímenes terapéuticos, sin embargo el uso de esta antraciclina conlleva la aparición de multitud de efectos adversos (cardiopatías, nefropatías, etc.) derivados en gran parte del estrés oxidativo tan elevado que genera, razón por la cual la terapia preventiva con el uso de antioxidantes que mitiguen su toxicidad está en pleno auge. El aceite de oliva es conocido por la gran cantidad de sustancias antioxidantes que contiene, una de ellas es el hidroxitirosol, un compuesto fenólico que además de poseer una elevada capacidad antioxidante al eliminar eficazmente los radicales libres, presenta acción anticancerígena en cultivos celulares, antiinflamatoria, antimicrobiana, antiagregante plaquetario, etc., sin mostrar toxicidad asociada a elevadas dosis en animales y humanos. Justificación y objetivos: El enorme estrés oxidativo derivado del tratamiento con adriamicina (ADR) ocasiona daños tanto a las células tumorales como a las sanas, causando una gran variedad de efectos tóxicos; puesto que el hidroxitirosol (HT) se ha mostrado como un gran agente antioxidante con acción antiproliferativa en líneas celulares tumorales, el objetivo del presente trabajo es comprobar si la terapia combinada de adriamicina e hidroxitirosol (ADR+HT) reduce la toxicidad asociada a la antraciclina, sin disminuir o incluso potenciando la acción antitumoral de la misma. Por otra parte, se quiere constatar por primera vez en ratas con cáncer de mama si dicho antioxidante mantiene la capacidad antitumoral que presenta en cultivos celulares. Material y métodos: Para realizar el estudio se emplearon 44 ratas Sprague-Dawley hembras distribuidas de forma aleatoria en cuatro grupos experimentales: DMBA (grupo control con cáncer de mama), HT (grupo tratado con hidroxitirosol), ADR (grupo tratado con adriamicina), ADR+HT (grupo de terapia combinada) y CONTROL (grupo control sano sin cáncer). El cáncer de mama se indujo con una única dosis de 100mg/kg de DMBA (7,12-dimetilbenzo(α)antraceno) vía intragástrica. El hidroxitirosol se administró vía oral a una dosis de 0.5mg/kg/día, 5 días durante 6 semanas. La adriamicina se inyectó a través de la vena lateral de la cola a una dosis de 1mg/kg/semana durante 6 semanas. Se realizó una biopsia del primer tumor que alcanzó un volumen de 2cm3, y finalizados los tratamientos se sacrificaron los animales siguiendo el protocolo del Comité Ético de la Universidad de Granada. Se midieron los parámetros bioquímicos, oxidativos, niveles del antioxidante en plasma, pesos de los animales, parámetros tumorales, anatomía patológica y proliferación celular. Además se realizó un estudio de perfil genético mediante microarray en las muestras de tumores biopsiados en el momento inicial y al sacrificio. Los resultados obtenidos fueron validados mediante RTPCR cuantitativa. Resultados: Los grupos ADR y ADR+HT presentan un aumento del perfil lipídico (significativo para el primero pero no para el segundo) con respecto a los grupos CONTROL, HT y DMBA. En cuanto a la capacidad antioxidante plasmática, no se observan diferencias significativas entre ninguno de los grupos experimentales. El ensayo comet indica una tendencia a la reducción de la genotoxicidad tanto del HT solo como en combinación con la ADR, aunque tal descenso no es estadísticamente significativo entre los diferentes grupos. Además el antioxidante tiende a normalizar los niveles plasmáticos de coenzima Q9 (aunque no estadísticamente significativo) y Q10 (estadísticamente significativo) reducidos en ADR. Algo similar sucede con el tocoferol, que se encuentra elevado en el grupo ADR y el hidroxitirosol normaliza los niveles, haciéndolos similares a los del grupo CONTROL. En plasma se ha encontrado mayoritariamente hidroxitirosol (que fue mayor en el grupo HT que en ADR+HT) y la menor presencia la tiene el alcohol homovanílico, siendo superior en el grupo HT que ADR+HT. El grupo DMBA es el que mayor peso de los animales presenta, siendo significativo con respecto a ADR y ADR+HT (sin diferencias estadísticas significativas entre estos). El grupo HT presenta un peso superior que los grupos ADR y ADR+HT, e inferior que el de DMBA, aunque no es estadísticamente significativo para ambos casos. El HT retiene el crecimiento de los tumores mamarios de las ratas. Tanto a nivel de tumor trucut como del total de carcinomas el volumen no aumenta como en el caso del grupo DMBA, llegando incluso a compararse el volumen tumoral total con el que presenta los grupos ADR y ADR+HT. Además la combinación ADR+HT no afecta en modo alguno la capacidad antitumoral de la antraciclina, incluso hay un efecto sinérgico. El estudio de proliferación celular mediante la inmunotinción de Ki67 indica que el hidroxitirosol disminuye en la misma medida que la adriamicina y la combinación de ambos la presencia de Ki67 y por tanto la proliferación de las células tumorales. Desde el punto de vista histopatológico, los tumores mamarios inducidos con DMBA de nuestro trabajo presentan patrón cribiforme predominante y grados I y II fundamentalmente. Ni la ADR ni el HT combinado o no con la antraciclina evitan por completo el progreso de los tumores hacia grados superiores y otros patrones arquitecturales, aunque si lo disminuyen visiblemente. El HT parece ser el compuesto que menos promueve el aumento del grado de Bloom-Richardson con el paso del tiempo, e incluso la combinación con la ADR lo disminuye con respecto a la antraciclina sola. El estudio de perfil génico indica la presencia de genes implicados en apoptosis, proliferación, diferenciación, ciclo celular, oncogénesis, inmunidad, inflamación, defensa celular, metabolismo lipídico y oncogénesis, cuya expresión ha sido posteriormente validada mediante RTPCR cuantitativa. Tanto el análisis de microarray como la PCR indican elevada variabilidad entre las muestras analizadas de cada grupo estudiado con estas técnicas (HT, ADR, DMBA). Conclusiones: 1) El hidroxitirosol presenta capacidad antitumoral en ratas con cáncer de mama inducido con DMBA, disminuyendo de forma significativa el volumen tumoral y la proliferación de las células cancerígenas, además de reducir la progresión hacia grados histopatológicos superiores. 2) El hidroxitirosol no altera de forma significativa los parámetros bioquímicos plasmáticos. El tratamiento combinado del mismo con adriamicina no supone una mejora significativa de los efectos oxidativos promovidos por el fármaco. 3) El tratamiento con hidroxitirosol altera los patrones de expresión génica en los tumores. Estos estudios nos llevan a proponer los siguientes mecanismos de acción del hidroxitirosol: a) bloqueo de la vía de señalización de supervivencia y proliferación celular Wnt, b) apoptosis ayudada por una probable estimulación del sistema inmune, c) detención del ciclo celular, d) descenso de los reservorios de lípidos destinados a la proliferación celular como consecuencia del incremento de la expresión de genes implicados en la β-oxidación, e) bloqueo y disminución de los niveles de factores de transcripción implicados en procesos oncogénicos. 4) El tratamiento con hidroxitirosol altera los patrones de expresión génica de las células tumorales y ejerce su acción antitumoral en cinco frentes: a) bloqueo de la vía de señalización de supervivencia y proliferación celular Wnt, b) apoptosis ayudada por una probable estimulación del sistema inmune, c) deteniendo el ciclo celular, d) bloqueo y disminución de los niveles de factores de transcripción implicados en procesos oncogénicos, e) descenso de los reservorios de lípidos destinados a la proliferación celular por el incremento de la β-oxidación. CONCLUSIÓN GENERAL. El estudio que aquí se presenta demuestra por primera vez un potente efecto antiproliferativo del hidroxitirosol en animales de experimentación con cáncer de mama inducido con DMBA. Se trata de un componente minoritario del aceite de oliva virgen cuya acción antitumoral se asemeja al de la adriamicina, pero sin provocar sus efectos adversos. Su mecanismo de acción podría estar relacionado con la alteración de la expresión de genes implicados en procesos biológicos relevantes para la supervivencia y proliferación de las células tumorales.