Nuevas metodologías en análisis de alimentos con el uso compartido de nanopartículas

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª Juan Godoy Navajas El resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis: 1. Introducción o motivación de la tesis El objetivo genérico de las investigaciones que constituyen esta Memoria ha sido el desarrollo de métodos rápidos para el análisis de alimentos utilizando, básicamente, las especiales propiedades que presentan distintos nanomateriales. Los nanomateriales han presentado una amplia aplicabilidad en bioanálisis [1-3], pero su utilidad analítica en otras áreas de aplicación, tales como análisis de alimentos y ambiental ha sido más restringida. Los estudios realizados han pretendido expandir la aplicabilidad analítica de la Nanotecnología para abrir nuevas vías, alternativas a las ya establecidas, que mejoren el control de la calidad alimentaria. Para alcanzar este objetivo se han realizado las siguientes investigaciones: 1) Síntesis y caracterización de nanopartículas de sílice dopadas con los fluoróforos de larga longitud de onda azul nilo y violeta de cresilo y su utilización para formar marcadores aplicables a la determinación de macromoléculas y moléculas pequeñas en alimentos mediante inmunoensayo heterogéneo. 2) Desarrollo de nuevas metodologías analíticas para la determinación de parámetros globales en alimentos, tales como la capacidad antioxidante y contenido de polifenoles, utilizando fluorimetría de larga longitud de onda y nanopartículas de óxido de terbio, respectivamente. 3) Estudio sistemático de la utilidad del fenómeno de transferencia de energía de resonancia luminiscente (LRET) entre nanocristales de iones lantánidos, que presentan luminiscencia anti-Stokes (¿upconverting nanophosphors¿), y fluoróforos orgánicos para la determinación de biotina mediante ensayos de afinidad en medio homogéneo. 2. Contenido de la investigación Las investigaciones incluidas en esta Tesis Doctoral se pueden agrupar en tres temáticas fundamentales, como ya se ha comentado en el apartado de introducción: 1) síntesis de nanopartículas de sílice luminiscentes a larga longitud de onda y su aplicación al desarrollo de inmunoensayos heterogéneos con aplicación en análisis de alimentos, 2) propuesta de nuevos métodos para la determinación del contenido en sustancias antioxidantes y, por último, 3) utilización de ¿upconverting phosphors¿ en ensayos de afinidad mediante transferencia de energía resonante luminiscente. El primer método aborda la síntesis de nanopartículas de sílice dopadas con los fluoróforos de larga longitud de onda azul nilo y con violeta de cresilo. Las excelentes propiedades de las nanopartículas dopadas con azul nilo han propiciado su uso como reactivos marcadores en inmunoensayo, habiéndose desarrollado con posterioridad dos métodos de inmunoensayo: en uno de ellos se determina un hapteno de baja masa molecular, como el monensín, mientras que el segundo ha sido útil para la determinación de especies de elevada masa molecular, como las proteínas de soja. Para ambos inmunoensayos, los límites de detección obtenidos son más bajos que los límites de detección de otros inmunoensayos, como los ELISA. Estos métodos de inmunoensayo han permitido eliminar las etapas de adición de sustrato e incubación requeridas en los métodos ELISA, por lo que se simplifican los métodos de inmunoensayo utilizados de forma tradicional para la determinación de estas especies. El bajo límite de detección obtenido para el antibiótico monensín, con un valor de 0.015 ¿g L-1, ha permitido su determinación en muestras de leche con un tratamiento sencillo para eliminar las proteínas. Estas investigaciones se han publicado en las revistas Journal of Fluorescence, Analytica Chimica Acta y Talanta. Dos corresponden a revistas situadas en el primer cuartil, mientras que el primer artículo de la síntesis se publicó en una revista del segundo cuartil. El segundo bloque de la Tesis aborda el desarrollo de dos nuevos métodos de determinación de sustancias antioxidantes en alimentos. En primer lugar, se ha desarrollado un método ORAC que utiliza azul nilo como reactivo, alternativo al uso de fluoróforos convencionales, tales como fluoresceína y ficobiliproteínas. La sensibilidad del método propuesto es similar a la ofrecida por los métodos convencionales, pero la emisión a larga longitud de onda del fluoróforo utilizado permite eliminar interferencias espectrales debidas a la matriz de la muestra y se minimizan también los fenómenos de dispersión debidas a los estrechos desplazamientos Stokes de fluoresceína y ¿-ficoeritrina. El método se aplicó a la determinación de la capacidad antioxidante de muestras de zumos y vinos con excelentes resultados, los cuales no difieren significativamente cuando se comparan con el método tradicional que utiliza fluoresceína como fluoróforo. Estas investigaciones se han publicado en la revista Journal of Agricultural and Food Chemistry. El segundo método desarrollado se centra en la determinación de antioxidantes en muestras de alimentos mediante el uso combinado de la enzima laccasa y de nanopartículas de Tb4O7.y utilizando ácido gálico como estándar. El uso de las nanopartículas de Tb4O7 permite reducir la concentración de laccasa utilizada y mejora el límite de detección frente al obtenido en ausencia de las nanopartículas de Tb4O7. Asimismo, la rapidez de las determinaciones aumenta en presencia de dichas nanopartículas. El parámetro analítico utilizado es el área neta bajo la curva, la cual es directamente proporcional a la concentración de analito. Otras sustancias antioxidantes no interfirieron la determinación al mismo nivel de concentración que el analito, a excepción del ácido ascórbico. Por tanto, el método es más selectivo que el método de Folin-Ciocalteu, donde sustancias reductoras presentes en la muestra pueden interferir la determinación dando lugar a errores por exceso en la determinación. Este trabajo se ha enviado para su publicación en la revista Food Chemistry. Las investigaciones incluidas en el tercer bloque, relativo al uso de ¿upconverting phosphors¿ en ensayos de afinidad homogéneos mediante transferencia de energía resonante luminiscente, han estado orientadas al estudio sistemático de diversos pares dador-aceptor. Este estudio ha tenido como objetivo: 1) demostrar la eficacia de nanocristales dopados con Ho(III) y Tm(III) en dichos ensayos y, 2) investigar la utilidad de los fluoróforos Alexa Fluor para formar aceptores adecuados. Estas investigaciones abren nuevas posibilidades en cuanto al uso simultáneo de varios pares dador-aceptor en ensayos multiplex. En todos los casos, los métodos propuestos permiten la determinación de biotina a niveles de concentración nM. Los resultados de estas investigaciones han sido presentados en un congreso internacional y han originado un artículo científico, el cual se encuentra actualmente en redacción. 3.Conclusión Las investigaciones presentadas en esta Tesis Doctoral han contribuido a expandir la aplicabilidad de la Nanotecnología al análisis de alimentos mediante el desarrollo de diversos métodos que presentan niveles adecuados de sensibilidad y selectividad. El uso de microplacas ha permitido la automatización de estos métodos con un bajo consumo de muestras y reactivos y una elevada velocidad de muestreo. A partir del trabajo realizado se extraen las siguientes conclusiones: 1) Se han sintetizado nanopartículas de sílice dopadas con los fluoróforos de larga longitud de onda violeta de cresilo y azul nilo. La utilización de estos nanomateriales con fines analíticos permite mejorar simultáneamente la selectividad espectral, evitando la señal de fondo de la matriz de la muestra, y la sensibilidad, consecuencia de su elevada relación superficie/volumen. Los principales resultados obtenidos con estas nanopartículas se resumen a continuación: La síntesis mediante el método de formación de microemulsiones en micelas inversas proporciona nanopartículas con un mayor porcentaje de fluoróforo encapsulado que con el método Stöber, que en general es más utilizado. Los nuevos nanomateriales desarrollados presentan mayor estabilidad fotoluminiscente que los fluoróforos orgánicos en disolución. La interacción entre las cargas positivas de estos fluoróforos y las cargas negativas de la matriz de sílice favorece la estabilización de los fluoróforos encapsulados, no siendo necesario su enlace covalente a dicha matriz de sílice. La versatilidad y aplicabilidad analítica de las nanopartículas de sílice dopadas con azul nilo se ha puesto de manifiesto mediante su uso para formar marcadores en fluorinmunoensayo heterogéneo. Se ha demostrado su utilidad para la determinación de macromoléculas como las proteínas de soja y moléculas pequeñas como el antibiótico de uso veterinario monensín. Los dos métodos de inmunoensayo desarrollados constituyen una alternativa útil frente a los métodos ELISA normalmente usados para la determinación de estas especies, ya que alcanzan menores límites de detección y evitan la etapa adicional para la medida de la actividad enzimática. La elevada sensibilidad obtenida con estos marcadores permite realizar medidas de fluorescencia en superficie sólida utilizando pocillos de menor volumen que los convencionales, lo que disminuye el consumo de reactivos y el coste de los ensayos. 2) Se ha desarrollado un nuevo método ORAC para la determinación de la capacidad antioxidante en zumos y vinos con el uso del fluoróforo de larga longitud de onda azul nilo como reactivo, mejorando la selectividad espectral de las determinaciones convencionales basadas en el uso de fluoresceína o de ¿-ficoeritrina. 3) Se ha propuesto un nuevo método enzimático con detección fluorimétrica para la determinación de polifenoles en vinos basado en el uso del fluoróforo 8-hidroxipireno 3-sulfonato sódico como nuevo sustrato de la laccasa y de nanopartículas de óxido de terbio como activadores de esta enzima. Se ha demostrado que el límite de detección del método en presencia de estas nanopartículas es tres veces inferior al obtenido en su ausencia. 4) Se ha ampliado el campo de aplicación de los procesos basados en transferencia de energía de resonancia luminiscente (LRET) utilizando nanocristales de iones lantánidos que presentan luminiscencia anti-Stokes, denominados ¿up-converting nanophosphors¿, como dadores de energía, y fluoróforos orgánicos que emiten en el visible, como aceptores. Las conclusiones más destacables de este estudio son las siguientes: o Se han obtenido señales LRET adecuadas utilizando nanocristales dopados con Er(III), Ho(III) y Tm(III) con diámetros medios de unos 100 nm como dadores, y, b-ficoeritrina, R-ficoeritrina y Alexa Fluor 680 como aceptores. o Mediante ensayos de afinidad homogéneos, utilizando el sistema biotina-estreptavidina, se ha obtenido la mayor luminiscencia con el par formado por nanocristales dopados con Er(III) y ¿-ficoeritrina. No obstante, se ha demostrado que los pares formados por nanocristales dopados con Ho(III) y Tm(III) como dadores y b-ficoeritrina y R-ficoeritrina como aceptores también originan señales luminiscentes adecuadas, permitiendo en todos los casos la determinación de biotina a nivel nM. 5) Se ha demostrado la utilidad analítica de la mayoría de los métodos desarrollados mediante su aplicación al análisis de diversos alimentos, tales como vinos, zumos y leche. Las propiedades analíticas que presentan estos métodos han permitido que las determinaciones realizadas no requieran tratamientos de muestra complejos, siendo sólo necesaria la dilución de las muestras de vinos y zumos y la desproteinización de las muestras de leche. 4. Bibliografía (1) Gómez-Hens, A.; Fernández-Romero, J.M.; Aguilar-Caballos, M.P. Nanostructures as analytical tools in bioassays. Trends Anal. Chem., 27 (2008) 394-406. (2) Gómez-Hens, A.; Fernández-Romero, J.M.; Aguilar-Caballos, M.P. Control of tumors markers using nanotechnology. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 9 (2009) 1064 - 1074. (3) Gómez-Hens, A.; Fernández-Romero, J.M.; Aguilar-Caballos. High-throughput bioassays using nanoparticles. Comb. Chem. High Thr. Screen. (2010) 309 - 317.