Evaluación genética y microanalítica de las células madre de la gelatina de wharton para su utilización en ingeniería tisular

Resumen

Las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical son células multipotenciales con capacidad de diferenciación hacia tejidos de origen mesodérmico, las cuales pueden ser utilizadas en la Terapia Celular y Tisular. La utilización de las células madre de la gelatina de Wharton para este propósito tiene una gran ventaja sobre otras células madre, y es que son una fuente asequible tanto ética como técnicamente, por lo que los estudios in vivo estarían validados. En este contexto, para que los protocolos clínicos sean llevados a cabo con éxito, es importante asegurar la viabilidad de las células que van a ser utilizadas en la Terapia Celular y la Ingeniería Tisular. En este sentido, existen numerosos métodos para evaluar la viabilidad de las células mantenidas en cultivo entre las que podemos destacar los ensayos con tinciones de exclusión con colorantes vitales como el azul tripán; la microscopía electrónica analítica por energía dispersiva de rayos X; y, las técnicas de microarray, los cuales, permiten determinar los niveles de expresión de todos los genes de una muestra celular incluyendo aquellos relacionados con mortalidad celular. Por tanto, los objetivos planteados al inicio de esta Tesis Doctoral fueron los siguientes: 1. Aislar y caracterizar las células madre de la gelatina de Wharton. 2. Evaluar la viabilidad de las células de la gelatina de Wharton mediante azul tripán. 3. Evaluar la viabilidad de las células de la gelatina de Wharton mediante microanálisis. 4 Evaluar la viabilidad de las células de la gelatina de Wharton mediante microarray. 5. Establecer un patrón de viabilidad de las células madre de la gelatina de Wharton mediante las técnicas mencionadas. Para alcanzar cada uno de los objetivos planteados lo primero que se hizo fue aislar las células de la gelatina de Wharton de cordones de recién nacidos a término. Para el aislamiento de estas células se utilizaron métodos mecánicos y enzimáticos. Una vez aisladas, las células de la gelatina de Wharton se cultivaron en frascos de cultivo. Cuando las células estaban subconfluentes se subcultivaron en nuevos frascos de cultivo obteniéndose el siguiente subcultivo. De esta manera, se analizó la viabilidad de las células del cultivo primario y de los seis subcultivos siguientes mediante la técnica de azul tripán, la microscopía electrónica analítica y el microarrays por oligonucleótidos. Los resultados revelan que la metodología descrita en esta Tesis Doctoral permite el aislamiento eficaz de las células de la gelatina de Wharton. Por otro lado, la técnica de azul tripán mostró que las células de la gelatina de Wharton presentan una alta viabilidad celular, mostrando mayor viabilidad el cultivo primario, el cuarto y el quinto subcultivo. Así mismo, los ensayos de viabilidad mediante microanálisis sugieren que las células de la gelatina de Wharton presentan elevada viabilidad celular en el cuarto y el quinto subcultivo, experimentando un proceso de muerte por apoptosis en el primer y sexto subcultivo. Finalmente, el análisis de viabilidad mediante microarray reveló un elevado número de genes sobreexpresados en el cultivo primario con tendencia decreciente a partir del primer subcultivo, comprobándose que el número de funciones génicas relacionadas con mortalidad era del 2,5% para todos los subcultivos siendo más elevado este número de funciones génicas relacionadas con mortalidad celular en el cultivo primario. Esto sugiere que las células en el cultivo primario experimentan un proceso de adaptación progresivo a las condiciones de cultivo. En conclusión, las células viables para ser utilizadas en los protocolos clínicos de Terapia Celular e Ingeniería Tisular son los del cuarto y quinto subcultivo porque presentan una mayor viabilidad medida a través de las técnicas de azul tripán y microanálisis, así como un menor número de funciones génicas sobrexpresadas relacionadas con mortalidad celular