Resistencia a drogas inducida por concentraciones plasmáticas de paclitaxel y carboplatino. Determinación del gen mdr1 en sangre periférica como marcador de respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de pulmón

Resumen

El cáncer de pulmón (CP) constituye uno de los mayores problemas de salud en el mundo por su elevada mortalidad y porque su incidencia sigue una curva ascendente en los últimos años. En la Unión Europea se diagnostican cerca de 180.000 casos nuevos de cáncer de pulmón al año y el 85-90% de los pacientes mueren a causa de su tumor. El tabaco es el agente etiológico más frecuentemente relacionado con el CP. Estudios epidemiológicos de cohortes de fumadores han establecido la relación causal entre tabaco y cáncer de pulmón, en hombres y mujeres. Se estima que el tabaco es el responsable del 80% de muertes por este tipo de cáncer en hombres y, del 75% en mujeres. El CP se puede dividir en dos grandes grupos por sus características histológicas, curso clínico y respuesta al tratamiento: el cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) o microcítico, que representa el 20% del total de cánceres de pulmón; y el cáncer de pulmón no células pequeñas (CPCNP) o no microcítico, que correspondería al 80% restante. Este último constituye un grupo heterogéneo que incluye el carcinoma epidermoide o de células escamosas, el adenocarcinoma y el carcinoma de células grandes, como miembros más representativos. La mayoría muestra más de un patrón histológico. El CPCNP suele tener un crecimiento más lento y menos agresivo que el microcítico, a pesar de lo cual supone la causa de muerte por cáncer más importante. La muerte se produce principalmente por diseminación metastásica.La posibilidad de curación está por debajo del 15%, aunque el riesgo de muerte ha disminuido en los últimos años. En el CPCNP podemos hablar de cuatro estadios según la clasificación TNM: I,II,III y IV. De forma general podemos decir que los estadios I y II corresponden a enfermedad localizada. En esta situación la intención del tratamiento es curativa y la cirugía juega un papel relevante en la estrategia terapéutica. El estadio III corresponde a enfermedad loco-regional. El estadio IV corresponde a enfermedad metastásica. La supervivencia en estadios localmente avanzados (III) es de 10-20% a los 5 años. En estadios metastásicos es menor del 5% a los dos años. El tratamiento quimioterápico en esta neoplasia está justificado, tanto en la enfermedad local como en la avanzada, pues se ha demostrado su beneficio clínico en términos de calidad de vida, aumento del intervalo libre de enfermedad, aumento del tiempo a la progresión y aumento de la supervivencia global. Sin embargo, el CPCNP constituye una entidad muy heterogénea que, a veces, se muestra quimiorresistente y no responde al tratamiento. En el desarrollo de resistencia a quimioterapia están implicados distintos factores, entre ellos, la adquisición del fenotipo de resistencia a múltiples drogas o fenotipo mdr (mmultidrug resistance). El fenotipo MDR constituye la mayor causa de fallo en el tratamiento con quimioterapia. Se ha relacionado con la expresión de una serie de proteínas: Glicoproteína P o PgP, familia Multidrug Resistance Protein o MRP (MRP1-7), Lung Resistance Related Protein o LRP, Breast Cancer Resistance Protein o BCRP. Glicoproteína P, MRP y BCRP, pertenecen a la familia ATP-binding-cassette (ABC) transporters. LRP forma parte de los complejos vault . ATP-binding-cassette transporters constituye una familia de proteínas de membrana, capaces de transportar una gran variedad de compuestos: lípidos, sales biliares, compuestos tóxicos y péptidos presentadores de antígenos, principalmente. Realiza este transporte a través de la membrana, en contra de gradiente de concentración y a costa de la hidrólisis de adenosín trifosfato (ATP). Entre los sustratos de los ABC transporters se encuentran fármacos antineoplásicos, principalmente derivados naturales como taxanos, alcaloides de la vinca, antraciclinas y epipodofilotoxinas. Los estudios en tumores sólidos sobre la expresión de estas proteínas se han realizado principalmente en líneas celulares experimentales y muestras del tejido tumoral. Los resultados son variables, debido en gran medida a las diferencias en la metodología empleada. Sin embargo se puede concluir que existe una relación entre la expresión de estos marcadores y la resistencia a la quimioterapia. Existen estudios de detección de los niveles de las proteínas mencionadas en células de sangre periférica aunque son muy escasos y los resultados no son concluyentes. No obstante el análisis de la expresión de estos genes en sangre periférica es factible y puede aportar información muy importante de una manera fácil y cómoda para el paciente. La posible determinación de estas proteínas supone una nueva vía de investigación ya que podría comportarse como marcadores pronósticos de la enfermedad. Nuestro proyecto de investigación consiste en el estudio de la resistencia a quimioterapia, mediada por el fenotipo mdr, en CPCNP, tanto en líneas celulares como en sangre de pacientes afectos. Se han utilizado 5 líneas celulares, obtenidas de la ATCC (American Type Cultura Collection), del Nodo de la Red de Bancos de Tumores de Andalucía o del Banco de Células del CIC (Centro de Instrumentación Científica). Las líneas A549 y A 427 derivan de carcinoma epitelial de pulmón. La línea NODO se obtuvo a partir de una metástasis de carcinoma de pulmón. Asimismo también se han usado 3 líneas derivadas de otros tumores: GAS, de cáncer gástrico; SEM, de seminoma; y MCF7, de cáncer de mama. Estas líneas celulares han sido expuestas a Paclitaxel, Carboplatino, y a la combinación de ambos. Los fármacos fueron suministrados por la Farmacia del H. Virgen de las Nieves. Se utilizaron concentraciones similares a las concentraciones plasmáticas que se observan en pacientes tratados. Se ha evaluado el impacto en la proliferación celular, la inducción de apoptosis, y la expresión de mdr1 y MRP3, tras la exposición a dichos fármacos y su combinación. Para medir los cambios en la proliferación celular se escogió el método MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Las células viables metabolizan el compuesto y producen sal de formazán, mientras que las no viables no lo metabolizan. La densidad óptica fue medida mediante un colorímetro Titertek multiscan a 570 y 690 nm. Los valores obtenidos se transformaron en valores de números de células y para la recta de progresión se utilizó el programa estadístico Statgraphics plus para Windows v. 5.1. El estudio de morfología celular se realizó con microscopio óptico Nikon Eclipse Ti, a las 8, 24, 48 y 72 horas. Además el estudio se completó con seguimiento de varias semanas. Para el estudio de apoptosis se utilizó la técnica de anexina V, acompañada de la tinción con Ioduro de Propidio. Las células se analizaron con microscopio confocal Invertido Leica DMI6000. La determinación de la expresión de los genes de resistencia MDR1 y MRP3 en las diferentes líneas, se hizo mediante la técnica RT-PCR y cuantificación por densitometría. En el estudio densitométrico se usó como control la expresión en beta-actina.. Con el objeto de analizar los posibles cambios de expresión génica que provoca el tratamiento de Paclitaxel y Carboplatino en pacientes con CP, se ha realizado un estudio mediante arrays en PMN de sangre periférica de 2 pacientes con CPCNP. Se realizó una determinación basal, antes del primer ciclo; y una determinación tras el tratamiento, a los 21 días. El estudio se centró en los genes de resistencia mdr. En base a estos resultados, se ha realizado un estudio de la expresión de MDR1 en PMN de sangre periférica de 23 pacientes con CPNCP, antes y después del tratamiento con Paclitaxel y Carboplatino, con el fin de establecer si constituye un factor predictivo de respuesta y factor pronóstico de la enfermedad. Se realizó extracción sanguínea de 5ml antes y después de la quimioterapia, a cada paciente. Se obtuvo el pellet de PMN y el ARN de las células. Los ARN se chequearon en geles de agarosa y posteriormente se realizó RT-RNA, usando el primers específicos. Nuestros resultados demuestran que el paclitaxel a concentraciones plasmáticas provoca una importante reducción de la proliferación, tanto en las líneas derivadas de tumor primario (A549, A427), como en la derivada de una metástasis (NODO). En las líneas derivadas de otros tumores, paclitaxel obtuvo una inhibición de la proliferación significativamente menor, que en las líneas de CP. El carboplatino produjo una reducción de la proliferación menor que el paclitaxel en las líneas de CP. Asimismo, la inhibición de la proliferación en las líneas derivadas de otros tumores fue menor que en las de CP. Cuando las líneas son expuestas a la asociación de ambos fármacos, aumenta la inhibición de la proliferación, en relación a la utilización de los fármacos de forma individual. Sin embargo el efecto no es sumatorio. El estudio morfológico se realizó sólo tras la exposición a la asociación de Paclitaxel- Carboplatino a concentraciones plasmáticas. En las líneas A549 y 427 se observaron cambios morfológicos, con aparición de calvas celulares por muerte celular. Sin embargo, en ambos casos destacó la presencia de pequeños núcleos de células que en presencia de los fármacos se fueron replicando, de manera similar a las células parentales, y tuvieron capacidad para formar una nueva monocapa. Este hecho sugiere que las células eran resistentes al tratamiento. La línea NODO se caracterizó por un crecimiento mucho más lento. No aparecieron calvas celulares, sino que se observó una disminución de la densidad celular. Se apreciaron células que no murieron y continuaron con capacidad de replicación, aunque inferior a la de las células parentales. La línea SEM no mostró un cambio morfológico propiamente dicho, sino una reducción en la densidad celular, aunque se mantuvo elevada. También se detectó la presencia de núcleos celulares que comenzaron a replicarse. La línea GAS se comportó de manera similar a la línea SEM. La línea MCF-7 se comportó como la línea A549. El estudio de apoptosis en las líneas celulares tras la exposición a paclitaxel, carboplatino y paclitaxel-carboplatino, reveló que en las líneas de CP ambos fármacos inducen apoptosis, si bien la generada por carboplatino fue ligeramente mayor. Además la adición de ambas drogas produjo incremento de la apoptosis. Por último, se realizó un estudio sobre el patrón de resistencia que induce el tratamiento con paclitaxel, carboplatino y la asociación de ambos. La línea A549 no presentaba expresión basal de MDR1 pero sí débilmente de MRP3. Tras la exposición a quimioterapia, se observó que paclitaxel induce MDR1 y carboplatino MRP3. La combinación induce la expresión de ambos, si bien la asociación de paclitaxel a carboplatino no incrementa de manera significativa MRP3. La línea A427 no presentó expresión basal de MDR1 y MRP3. Paclitaxel induce MDR1 y carboplatino MRP3. Como en el caso anterior, la asociación aumenta significativamente expresión de MDR1, y sin embargo muy poco la de MRP3. La línea NODO no presentó expresión basal. Paclitaxel induce MDR1 y carboplatino MRP3. Las líneas derivadas de otros tumores se comportaron de forma similar a las pulmonares. Eran negativas en su expresión basal. Paclitaxel induce MDR1 en todas. Carboplatino no indujo MDR1 como en los casos anteriores, pero tampoco MRP3 en la línea GAS. Finalmente se realizó el estudio de expresión de genes mdr en sangre de pacientes afectos de CP. En primer lugar se realizaron microarrays en 2 pacientes, hallando, tras la administración de tratamiento con paclitaxel-carboplatino, sobreexpresión de proteínas transportadoras relacionadas con la resistencia a fármacos (MDR1 y LRP). A partir de estos resultados, se llevó a cabo un estudio en 23 pacientes con CPCNP, estadios avanzados en la mayoría de los casos, y que no habían recibido tratamiento previo. Se estudió la expresión de MDR1 solamente. Todos los pacientes recibieron quimioterapia con paclitaxel-carboplatino. Se encontró sobreexpresión de MDR1 tras el tratamiento en 22 pacientes. Se catalogó de forma aleatoria el nivel de expresión, de modo que nivel bajo correspondía a sobreexpresión menor de 3, y nivel alto a mayor de 4. 11 pacientes presentaron niveles altos y 11 niveles bajos. El objetivo principal era determinar la relación entre la expresión de MDR1 y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, no se encontró una relación significativa. Tampoco se encontraron diferencias de expresión significativas en cuanto al resto de variables: género, hábito tabáquico, pérdida de peso al diagnóstico, estadio tumoral, histología del tumor. Además, la expresión de MDR1 no se correlacionó con la supervivencia. Nuestro proyecto tiene como fin avanzar en la utilidad real que poseen los genes de resistencia mdr en la predicción de la respuesta al tratamiento y el pronóstico de la enfermedad. En el momento actual hay estudios en marcha que evalúan otros marcadores moleculares, como ERCC1 y BRCA1, como factores predictivos de respuesta a determinados fármacos, y factores pronóstico. Estos estudios, al igual que nuestra investigación, tratan de establecer perfiles genéticos con determinada sensibilidad o resistencia al tratamiento, y así llegar a una individualización de la terapia antitumoral en el CPCNP. Nuestros resultados en líneas celulares, apoyan los de otros trabajos realizados en líneas tumorales y/o tejido tumoral .Así, la expresión de MDR1 y familia MRP puede constituir un mecanismo de resistencia muy importante en el CPNCP. No obstante, es muy complicado el estudio prolongado de marcadores biomoleculares en tejido tumoral, por su difícil acceso. Por ello se debe intentar el análisis de estos genes en la sangre periférica de los pacientes, ya que esto podría ofrecernos una información continuada del comportamiento biológico del tumor. En nuestro estudio, hemos encontrado un incremento de la expresión de MDR1, tras la administración de quimioterapia. Sin embargo este hecho no se ha relacionado con respuesta al tratamiento ni supervivencia, por lo que podemos concluir que la expresión de MDR1 en sangre periférica no constituye un factor predictivo de respuesta ni un factor pronóstico. A pesar de estos resultados, es importante seguir investigando en la biología molecular del CPCNP e intentar establecer subgrupos de pacientes en base a perfiles genéticos. Para ello contamos con nuevas tecnologías, como el uso de microarrays.