In situ observation of protein crystal growth by advanced optical techniques

Resumen

En la primera parte de este trabajo se ha comparado el papel de la Microscopia de Fuerza Atómica (AFM) y de la Interferometría con Cambio de Fase (PSI), como técnicas de caracterización en el crecimiento cristalino, frente al papel que desempeña la Microscopia Confocal con contraste de Fase Diferencial (LCM-DIM). Para ello y mediante estas tres técnicas, se ha observado el crecimiento de una proteína modelo, lisozima de clara de huevo, y se han medido diferentes parámetros como: el avance del escalón; la tasa de nucleación 2D y el avance de la cara. El estudio se ha llevado acabo con cristales tetragonales en un amplio rango de sobresaturaciones, crecidos a partir de una solución purificada de lisozima. Se ha demostrado que la técnica de AFM no es la más apropiada para la determinación cuantitativa y precisa de parámetros mesoscópicos o macroscópicos del crecimiento cristalino. Por otro lado, AFM es una potente herramienta, y una técnica muy útil para determinar parámetros cinéticos y termodinámicos del crecimiento cristalino a nivel molecular, especialmente a niveles de supersaturaciones bajas. Esta técnica tiene una excelente resolución vertical que permite un buen análisis a escala atómica de las características morfológicas de los cristales de proteínas. Con un buen sistema modelo y un operador experimentado, es posible determinar parámetros termodinámicos y cinéticos del crecimiento cristalino a nivel molecular. La segunda parte de este trabajo está enfocada al estudio de la morfología y cinética de crecimiento de cristales tetragonales de lisozima a partir de soluciones con una composición determinada, empleando avanzadas técnicas ópticas. La nucleación 2D resultó ser el mecanismo de crecimiento dominante para ambas caras, {101} y {110}, de cristales tetragonales de lisozima, bajo las condiciones de estudio empleadas. El crecimiento por dislocación helicoidal sólo se observó ocasionalmente cuando se incorporaron microcristales al volumen del cristal, o cuando los cristales sufrieron estrés mecánico, así mismo se ha observado que la anisotropía intrínseca de la velocidad del escalón cristalino es constante en función de la sobresaturación, y por primera vez, los coeficientes cinéticos se determinaron para diferentes direcciones cristalográficas, {101} y {110}. El cambio de temperatura no tuvo efecto sobre los coeficientes cinéticos, indicando que la barrera energética para incorporación de moléculas es relativamente alta. En el caso de la cristalización de lisozima en soluciones no agitadas, el proceso de incorporación de unidades de crecimiento a la cara del cristal contribuye significativamente al coeficiente cinético en el rango de sobresaturaciones C-Ce < 0-45mg/ml; por tanto, el crecimiento cristalino está controlado por la cinética de incorporación. En el rango sobresaturaciones elevadas, el transporte de masa cobra mayor importancia. A partir del análisis de la dinámica del escalón en función de los mecanismos de crecimiento, sobresaturación, direcciones cristalográficas y condiciones de transporte, se ha demostrado que el avance del escalón de islas 2D y dislocaciones helicoidales es constante en el tiempo bajo condiciones uniformes de solución. Para ninguna condición de crecimiento se han encontrado fluctuaciones no dependientes del tiempo en clara contradicción con las observaciones indirectas realizadas por interferometría, que predicaban una inestabilidad intrínseca de la dinámica de crecimiento por capas de cristales tetragonales de lisozima en condiciones similares (e.g. Vekilov et al., 1996).