Papel del receptor de glucocorticoides nr3c1 en el epitelio intestinal

Resumen

1. Introducción Los glucocorticoides (GC) son moléculas con efectos pleiotrópicos debidos a distintos y complejos mecanismos de acción que dependen en la mayoría de casos de su unión con el GR citoplasmático. Los mecanismos de acción del GR se pueden dividir fundamentalmente en tres: el GR puede actuar como un factor de transcripción activando (transactivación) o inhibiendo (represión) la expresión de distintos genes o uniéndose el GR a otros factores de transcripción modulando su actividad transcripcional por atadura (transrepresión). La mayoría de los efectos inmunomoduladores de los GC son los responsables de su uso en la terapia de la EII. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) define una condición inflamatoria crónica e idiopática del tracto gastrointestinal, que alterna períodos de inflamación y remisión. EII es una denominación que hace referencia a dos cuadros clínicos diferentes: enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU). Ambas formas disminuyen la calidad de vida del paciente y requieren un tratamiento farmacológico prolongado y/o cirugía. Lo que la hace una patología desafiante es su origen aún desconocido y sus impredecibles presentaciones y síntomas que evitan un tratamiento óptimo así como un aumento de la prevalencia. Hoy día existe una amplia variedad de GC sintéticos para su uso clínico en virtud de su efecto anti inflamatorio e inmunosupresor. En el tratamiento de la EII destacan la prednisolona y la metilprednisolone administradas vía sistémica o la budesonida oral que busca evitar los posibles efectos secundarios sistémicos debido a su carácter local y su alto metabolismo de primer paso hepático. El uso de GC en el tratamiento de la EII tiene algunas limitaciones. Actualmente solo el 40% de los pacientes responden de manera adecuada al tratamiento, mientras que el resto o no responden o lo hacen solo al principio pero adquieren dependencia cuando alcanzan el estado de remisión. Además, está aceptado que la administración de GCs no ofrece beneficios cuando se administran de manera prolongada en busca de aumentar el tiempo en estado de remisión. La evidencia experimental actual en el uso de GC en distintos modelos de colitis se basa en su uso empírico en humanos. De acuerdo con su conocido efecto anti-inflamatorio la mayoría de los resultados publicados indican un efecto positivo en la condición de los animales sin profundizar en su supervivencia. Sin embargo, en la colitis inducida por DSS, el efecto de los GC era sorprendentemente diferente. Nuestro laboratorio ha descrito recientemente que la budesonida ejerce tanto efectos protectores como perjudiciales en la colitis experimental en ratones. Por un lado, la budesonida incrementó la pérdida de peso, traslocación bacteriana, sepsis y sangrado rectal así como una mortalidad mayor. Por otro lado, parámetros inflamatorios como MPO o IL6 eran inferiores cuando los comparábamos con el grupo no tratado. También encontrados que la proliferación de IECs estaba inhibida al disminuir PCNA y ciclina D1 causando un incremento de la permeabilidad intestinal. Los ratones KO de GR no son completamente viables, fundamentalmente por fallo en la maduración pulmonar que conduce a la muerte prematura de los ratones. Existen una gran variedad de ratone KO condicionales de distintos tejidos. EN la piel (un tejido relativamente similar al epitelio intestinal) los ratones GR KO mostraban alteraciones en el desarrollo y un estado inflamatorio basal así como mayor susceptibilidad a agentes detergentes. Los ratones GR KO intestinales han sido generados con anterioridad, pero sólo se ha estudiado su impacto en la absorción de glucosa y su potencial papel en la gastroparesia inducida por GCs. Esta Tesis Doctoral intentará dilucidar que alteraciones tienen lugar después de la deleción del GR en el epitelio intestinal y su papel en la colitis inducida por DSS con o sin tratamiento con budesonida. 2. Material y métodos Para llevar a cabo los objetivos de esta tesis se han usado una amplia variedad de técnicas, incluyendo cultivo de explantes, RT-qPCR, histología, citometría de flujo, transporte iónico en cámara de Ussing, Western Blot, ELISA y colitis inducida por DSS. Se generaron ratones konockout inducibles condicionales de epitelio intestinal para el GR usando la tecnología Cre-lox en un fondo genético C57. 3. Objetivos Con base en los experimentos anteriores que se encuentran recogidos en el artículo que acompaña a esta tesis doctoral que sugerían un papel determinante del GR en el epitelio, se formularon los siguientes objetivos: 1. Caracterizar el papel del GR epitelial intestinal en la fisiología intestinal, particularmente en la función barrera de la mucosa e inflamación, así como su relevancia en el papel beneficioso o perjudicial de los corticoides en este contexto. 2. Mejorar el manejo clínico de la enfermedad inflamatoria intestinal con corticoides identificando posibles inconvenientes en sus efectos farmacológicos en esta patología, así como posibles maneras de subsanarlos. 4. Resultados y discusión Nuestros resultados se pueden dividir en dos partes: Caracterización de los ratones GR KO La deleción del gen fue inducida por la administración de tamoxifeno durante 5 días. Los ratones que no poseían el gen Cre, tanto Vel-Cre ERT2 o GRloxp/loxp, se usaron como controles. En estos experimentos se sacrificaron los animales a los 7 o 14 días desde la primera administración de tamoxifeno con el fin de descubrir los posibles cambios tras la deleción y un segundo punto a 14 días para ver si estos cambios persistían. Los ratones GR KO mostraban inicialmente (7 días) un estado inflamatorio moderado evidenciado por el incremento de S100A9 y p-STAT3 en tejido colónico. Además, los explantes colónicos secretaron niveles más altos de un amplio número de citoquinas como por ejemplo GM-CSF o TNFα. Uno de los múltiples efectos antiinflamatorios de los GCs está mediado por la unión por tethering del GR a los factores de transcripción STAT3 y NF-κB que son conocidos por aumentar la expresión de citoquinas pro inflamatorias. La producción de citoquinas puede estar incrementada de manera anormal debido a la falta de tethering por el GR en condiciones homeostáticas en las IECs provocando un efecto dominó en otras células inmunes. Este efecto fue abolido o incluso invertido 14 días después de la deleción, quizás por mecanismos compensadores, aunque algunos cambios persistieron (o incluso comenzaron) en esta etapa tardía. La condición inflamatoria no fue exclusiva del colon. En plasma se observó un incremento de IL6 o TNFα, mientras que la leptina (que se conoce que disminuye en la inflamación) estaba disminuida. Este efecto despareció completamente a los 14 días. El papel de los GCs en la proliferación celular es conocido. Para estudiar como la ausencia de GR estaba implicada en la proliferación medimos la expresión génica de ciclina D1 y cMYC, que estaban ambas incrementadas a 7 días. No se observaron grandes diferencias cuando medimos la expresión proteica de ciclina D1 o PCNA, aunque la tendencia observada era la misma. La activación de STAT3 puede conducir a un incremento de la expresión de ciclina D1. Nuestro trabajo ha encontrado también que en plasma estaba disminuido DKK1 en los ratones GRΔIEC. DKK1 actúa como inhibidor de la vía WNT-β-catenina. No conseguimos medir técnicamente ni β-catenina ni LRP6 por razones técnicas en IECs aisladas pero estamos planeando medirlo en organoides intestinales. Pese a la proliferación aumentada, el equilibrio entre los distintos tipos celulares epiteliales no se afectó, como se observó en la expresión génica de LGR5, LYZ1, MUC2 e IAP. Para dilucidar los mecanismos que subyacen a la respuesta compensadora se midió la presencia de corticosterona en explantes y plasma. La producción colónica aumentó únicamente a 14 días tras la deleción. Sin embargo, la corticosterona plasmática estaba disminuida tanto a 7 como a 14 días. Estos resultado junto con la falta de respuesta de la ACTH en la colitis por DSS (ver más adelante), apuntan a una inhibición del eje HAA en los ratone GR KO que deberá ser explorada en profundidad en el futuro. Los segmentos de colon tenían de alguna manera una apariencia sanguinolenta que se asoció con anemia, pero no hubo signos de sangrado en heces medida por dos técnicas diferentes. Este resultado puede ser interpretado por la presencia de algún tipo de hemorragia intramucosal pero es necesario confirmarlo con otras medidas. Papel del GR epitelial en la colitis inducida por DSS La budesonida se administró a ratones colíticos (tanto WT como GRΔIEC) de manera simultánea al DSS en agua de bebida que comenzó 7 días después d ela primera administración de tamoxifeno. Por tanto la colitis comenzó en el punto de máxima inflamación colónica a causa de la deleción del GR. En estos experimentos la administración de budesonida en ratones WT mostró de nuevo el aumento del DAI, teniendo en cuenta por ejemplo la evolución de peso corporal. Este empeoramiento fue dependiente de GR. Por otro lado, los ratones GR mostraron sangre en heces el día 1 de DSS mientras que en ratones WT este efecto no aparece al menos hasta día 2-4. Esto nos llevó a pensar que el estado inflamatorio observado en los ratones no colíticos en día 7 (sin DSS) alteraba la evolución clásica de la colitis por DSS. Por esta razón, realizamos un experimento que finalizó tan solo 24 horas tras la administración de DSS. Sin embargo, el incremento de la severidad de la enfermedad se revirtió al final del experimento, los ratones en el grupo GR DSS comenzaron a ganar peso al final del experimento terminando por encima del grupo WT. Si la budesonida se administra a los ratones WT se observa una pérdida de peso continua comenzando en los días 1-2 (en vez de en día 5 como ocurre en el grupo NT) que no aparece en los ratones GRΔIEC tratados con budesonida. Por tanto, los ratones GRΔIEC son más sensibles al daño inicial por DSS, potenciado la inflamación en respuesta a la deleción del gen aunque se encuentran protegidos en etapas más tardías. La respuesta inicial al DSS de los ratones GRΔIEC mostró signos colónicos de inflamación como una mayor infiltración, engrosamiento y erosión epitelial en el análisis histológico así como un aumento de la actividad fosfatasa alcalina y de la secreción de citoquinas en explantes (como MIP1α, MIP1β, GM-CSF, IP-10, MCP-1, RANTES, TNFα, etc.). Los niveles de S100A8/S100A9 eran también mayores en tejido colónico. Los marcadores inflamatorios sistémicos, que estaba aumentados en los ratones GRΔIEC sin DSS, no aumentaron por efecto de la colitis inicial. Los ratones que recibieron DSS mostraron una disminución importante de los niveles de DKK1 en plasma comparado con los ratones no colíticos incluso al comparar GR vs. WT. Las uniones estrechas parece estar menos expresadas desde el punto de vista proteico al medir claudina 2 y 4 aunque la permeabilidad macromolecular medida por FITC-dextrano 4KDa in vivo no estaba afectada. La corticosterona intestinal está aumenta en la colitis por DSS pero sin cambios en los ratones GRΔIEC. La expresión de LRH-1 no se modificó a tan solo 1 día de DSS pero sí aumentó de manera considerable en los ratones GRΔIEC tras 7 días de DSS, sugiriendo un mecanismo de feedback negativo mediado por el GR epitelial intestinal. 5. Conclusiones 1. La deleción del GR en las células epiteliales intestinales es estable y conduce a una respuesta inflamatoria moderada en el colon atribuible a la secreción de mediadores proinflamatorios por los enterocitos mostrando dependencia temporal. 2. La deleción del GR incrementa la proliferación de células epiteliales intestinales sin afectar de manera sustancial al equilibrio entre los distintos tipo celulares. 3. Los ratones con deleción epithelial de GR muestran signos de pérdida de sangre que se atribuyen a una hemorragia intramucosal que se potencia por la colitis experimental con DSS. 4. La deleción epitelial intestinal de GR empeora en gran manera la respuesta inflamatoria inicial al DSS, pero tiene un papel protector en etapas tardías debido tanto a una modulación en el tráfico de leucocitos como a una sepsis atenuada. 5. El eje HHA parece estar inhibido en los ratones GRΔIEC por mecanismos aún desconocidos. Este inesperado hallazgo requiere estudios adicionales y puede estar implicado en los efectos a nivel colónico. 6. La producción de corticosterona intestinal está potenciada en la colitis por DSS pero no se afecta en los ratones GRΔIEC pese a la evidencia de un mecanismo de feedback negativo por parte del GR sobre la expresión de LRH1, de acuerdo al aumento de la expresión en ausencia del receptor. 7. Los efectos perjudiciales de la budesonida en la colitis inducida por DSS están mediados por el GR epitelial intestinal. La protección puede deberse a que los efectos antiproliferativos de la budesonida en el epitelio no tienen lugar.