Estudio de la función inmunológica de la fosfatasa alcalina no específica de tejido

Resumen

1. INTRODUCCIÓN Las fosfatasas alcalinas (APs, ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa, EC 3.1.3.1) son una superfamilia de enzimas (glicoproteinas) ampliamente distribuidas, se encuentra desde en bacterias hasta en el hombre, que hidrolizan moléculas de fosfato a pH alcalino [1]. En humanos, hay cuatro isoformas: la intestinal (IAP), la placentaria, y la de células germinales, que son específicas de tejido, más la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP), ampliamente expresada. La isoforma TNAP está codificada por un solo gen. Alpl, que da lugar a las variantes de hígado, hueso y riñón (predominantes en estos órganos), que difieren a nivel de ARN mensajero (ARNm), ya que el primer exón es distinto en la isoforma ósea (exón 1A) y en las de hígado y riñón (exón 1B) [2, 3]. Por otro lado, la composición en aminoácidos de las 3 isoformas es idéntica, ya que el primer exón no se traduce, y solo difieren en la fracción glicosídica [1]. La TNAP ha sido extensamente estudiada debido a su implicación en diveros trastornosnos hepáticos, óseos y digestivos. Además, la TNAP es ampliamente conocida por ser esencial en el desarrollo de los huesos y los dientes. Entre otros, la TNAP parece ser esencial en el grecimiento axonal [4], así como la proliferación y diferenciación neuronal[5]. Estos efectos están relacionados con la señalización purinérgica mediante la hidrólisis de ATP, que de hecho está relacionado con el establecimiento de los circuitos neuronales [6]. Por otro lado, la producción de adenosina mediante la actividad 5’-ectonucleotidasa en la médula espinal dorsal es esencial para el mantenimiento de un buen tono purinérgico en los circuitos nociceptivos [7]. Por el contrario, nuevas evidencias apuntan a un efecto neurotóxico producido por la TNAP, por su capacidad para desfosforilar la proteina tau hiperfosforilada, que juega un papel clave en el Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas, desencadenando un aumento del calcio intracelular que desencadenará en muerte neuronal [8]. Además de lo anterior expuesto, el gen Alpl, que codifica la TNAP, se encuentra muy expresado durante la diferenciación terminal del adipocito, en la fase tardía de la adipogénesis, estando involucrado en el metabolismo lipídico y energético de los adipocitos, por lo que la TNAP podría regular el metabolismo de la glucosa y la sensibilidad a la insulina mediante la síntesis y secreción de adipoquinas [9]. El intestino delgado del ratón adulto expresa la IAP, aunque la TNAP también es expresada de forma transitoria deurante el estadio fetal. En los últimos años, la AP ha captado la atención debido a su papel protector anti-inflamatorio, al limitar la translocación bacteriana a través de la barrera de la mucosa, destoxificando el lipopolisacárido (LPS) de las bacterias Gram-negativas, así como atenuando la toxicidad e inflamación mediadas por el LPS [10-12].Diversos autores han sugerido el papel de la IAP en el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota intestinal, confiriéndole un potencial terapéutico contra la disbiosis y las infecciones patógenas [11]. En concordancia con estas observaciones, se han realizado varios estudios en humano que han probado la función defensiva de la AP a nivel intestinal. La administración de AP se ha asociado a una mejora a corto plazo en los índices de actividad de la enfermedad en pacientes con colitis ulcerosa [13]. Por otro lado, dos isoformas de fosfatasa alcalina, la intestinal (IAP) y la fosfatasa no específica de tejido (TNAP), están coexpresadas en el colon de ratón, estándo la última aumentada en modelos animales de enfermedad inflamatoria intestinal, al igual que en humanos [14]. Este aumento parece ser debido tanto a la infiltración leucocitaria al tejido colónico inflamado como a un aumento en la expresión de TNAP en células epiteliales [15-17]. Las células epiteliales colónicas expresan la TNAP tipo hígado en condiciones normales pero cuando son sometidas a estrés se produce un cambio en el patrón de glicosilación, cambiando a la isoforma TNAP tipo renal u ósea, resultando en un aumento de la actividad [15]. La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) es define una condición inflamatoria crónica, recurrente e idiopática, de tratamiento difícil y cuya etiología es esencialmente desconocida y que hace referencia principalmente a dos cuadros clínicos diferentes conocidos como Enfermedad de Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU). Ambas formas de EII afectan en gran medida a la calidad de vida del paciente, y requieren intervenciones médicas y/o quirúrgicas de forma recurrente. El auténtico reto de esta enfermedad es su causa, desconocida todavía, lo impredecible de su síntomatología, los escasos tratamientos disponibles y su creciente prevalencia especialmente en el mundo desarrollado. La respuesta inflamatoria se encuentra localizada en el intestino, y cursa frecuentemente con un aumento de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, así como la activación de diversas cascadas de señalización que juegan un papel esencial dirigiendo los efectos de diferentes mediadores inflamatorios solubles. Además, la TNAP se expresa en diferentes células inmunes. En células polimorfonucleares, la fosfatasa alcalina de neutrófilos (NAP) se localiza en vesículas secretoras que se relocalizan en la membrana celular tras la estimulación [18]. Igualmente, la TNAP se expresa en leucocitos, y se ha descrito su papel en la diferenciación de linfocitos B hacia células plasmáticas secretoras de anticuerpos [5, 6]. Sin embargo, poco se sabe del papel de la TNAP en linfocitos T [7]. 2. OBJETIVO Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, en esta Tesis Doctoral se propone caracterizar la implicación de la fosfatasa alcalina no específica de tejido en la actividad, diferenciación y proliferación de células del sistema inmunológico y más concretamente de linfocitos T. Se utilizarán para ello distintas herramientas incluyendo ratones heterocigotos para la expresión de TNAP e inhibidores específicos de AP. Además se estudiará la implicación en la respuesta inflamatoria de la TNAP expresada en linfocitos, utilizando un modelo de colitis por transferencia de linfocitos naïve de ratones heterocigotos para la TNAP a ratones Rag-1-/-, deficientes en linfocitos T y B maduros. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Para llevar a cabo el objetivo de la presente Tesis Doctoral, se utilizaron ratones heterocigotos para Alpl (referidos como TNAP+/-) C57BL/6 (B6.129S7-Akp2tm1Sor/J), con compañeros de camada wild-types (WT) como controles. Los ratones homocigotos Alpl KO no son viales. Una gran variedad de técnicas, incluyendo el cultivo celular, qRT-PCR, separación magnética celular y cultivo de células primarias para el estudio de células T in vitro, técnicas histológicas, citometría de flujo, ELISA y Multiplex, ensayos de proliferación, al igual que distintos modelos animales para el estudio de células T in vivo: activación de células T con el anticuerpo anti-CD3ε y colitis por transferencia linfocitaria. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El fenotipo de los ratones TNAP+/- era perfectamente normal, y eran indistinguibles de los ratones WT en términos de apariencia y comportamiento general. Se determinó la expresión de TNAP (Alpl) y la actividad AP en diversos tejidos. La presencia de un solo alelo de Alpl resultó en una disminución de los niveles de ARNm en todos los tejidos analizados, que se correlacionó con la disminución en la actividad enzimática de AP en riñón e íleon, pero no en otros órganos [19]. Sin embargo, la sensibilidad in vitro al inhibidor específico de AP levamisol indicó que las características enzimáticas habían cambiado, posiblemente debido a un cambio en el patrón de glicosilación, en lo que precisamente difieren los tres subtipos de TNAP [15, 17]. Con el fin de evaluar el papel de la TNAP en la función de las células inmunes, estudiamos la respuesta ex vivo de esplenocitos de animales WT y TNAP+/- a LPS y concanavalina A (ConA), y de linfocitos T a ConA y anti-CD3ε/anti-CD28. En términos de respuesta inmune, la activación de células inmunes resultó, en todos los casos, en una sobreexpresión de citoquinas pro-inflamatorias; IL-6, TNF-α, IFN-γ e IL-17A en caso de esplenocitos, y TNF-α, IFN-γ, IL-17A, IL-10 e IL-4 en linfocitos. En casi todos los casos se alcanzó significanción estadística. A pesar de la respuesta atenuada de las células T purificadas de ratones TNAP+/- a la estimulación, no se encontraron cambios en la capacidad de polarización de las células Th0, ya que los experimentos de polarización in vitro concluyeron con resultados similares en los distintas condiciones polarizantes, hacia Th1, Th2 y Th17, a las que se expuso a las células T naïve. Sin embargo, la proliferación de las células T si se vió afectada. Nuestros resultados muestran que las células T TNAP+/- muestran una menor respuesta proliferativa al estímulo anti-CD3ε/anti-CD28, aunque no a ConA, probablemente debido a la mayor respuesta obtenido con el primer estímulo. En este mismo experimento, no se encontraron diferencias significativas entre células WT y TNAP+/-, aunque la actividad AP en los linfocitos WT fue sensible a la inhibición por levamisol, al contrario que las células TNAP+/-. A pesar de que los niveles basales de ARNm y la actividad enzimática, incluyendo la sensibilidad a levamisol, fue comparable en las células T aisladas de animales WT y TNAP+/-, en caso de la estimulación in vivo de los animales con anti-CD3ε, se indujo significativamente la expresión de TNAP en las células T de ratones WT, aunque no en las de animales TNAP+/-. La administración de anticuerpos anti-CD3ε a los ratones resultó en la estimulación de las células T a corto plazo con un aumento de la liberación de citoquinas proinflamatorias, una rápida disminución de linfocitos T circulantes, y a un efecto inmunodepresor duradero [20, 21]. En los ratones WT, tuvo como resultado una marcada linfopenia y sobreexpresión de Ifng, Il4, Il5, y otras citoquinas. Por el contrario, los animales TNAP+/- mostraron una leve linfopenia, además de una baja producción de citoquinas en plasma y esplenocitos, consistente con la reducida activación de las células T. A continuación, nos planteámos la hipótesis de que la TNAP expresada en los linfocitos T estuviese involucrada en la respuesta inflamatoria in vivo en un modelo de colitis crónica, la colitis por transferencia linfocitaria. La transferencia de células T TNAP+/- naïve (ratones TNAP+/- naïve) a ratones Rag1-/- resultó en el desarrollo de colitis de menor grado de severidad comparada con la desarrollada por la transferencia de células T naïve de animales WT (ratones WT naïve), en particular una menor fibrosis. Además, los ratones TNAP+/- naïve presentaron una menor producción de citoquinas a nivel colónico (IFN-γ, TNF-α e IL-10, significativo para el primero) y menor expresión (significativo para IFN-γ e IL-1β), al igual que una expresión disminuida significativamente de T-bet, factor de transcripción para la diferenciación hacia Th1, consistente con la baja activación presente por parte del sistema inmune de estos animales. El siguiente paso fue determinar los niveles de citoquinas proinflamatorias en plasma, estando IFN-γ reducido de forma significativa en animales colíticos TNAP+/-, y en el sobrenadante del cultivo de esplenocitos estimulados con LPS o ConA, donde la producción de citoquinas estuvo reducida en un 31 y 40% para TNF-α (significativos), y un 57 y 13% para IFN-γ (no significativos), respectivamente. Estos resultados estuvieron en concordancia con los análisis de PCR de expresión génica, donde los niveles de ARNm de Tnf, Ifng, Il10 e Il17a fueron paralelos al nivel de citoquinas producidas, mierntras que la expresión de T-bet mostró una tendencia a la regulación negativa. Además, se estudiaron mediante citometría de flujo las diferenctes poblaciones de linfocitos T en los gánglios mesentéricos, células CD4+Foxp3+ y CD4+IFN-γ+.El porcentaje de células CD4+Foxp3+, representativa de células Treg, aumentó en el grupo de animales TNAP+/- naïve frente al grupo colítico WT naïve, resultados que fueron consistentes con el aumento significativo del nivel de ARNm de Il10 y Foxp3 en estas mismas células. Por contra, el porcentaje de células CD4+IFN-γ+ estuvo reducido en el grupo TNAP+/- naïve, frente al WT naïve aunque hubo un aumento en ambos grupos colíticos, consistente con los niveles elevados de IFN-γ en plasma. Nuestros resultados no nos permiten establecer el mecanismo subyacente al fenotipo de los linfocitos T TNAP+/-. Sin embargo, parece que las células T activadas aumentan la expresión de Alpl, con un incremento de la actividad y un aumento de la sensibilidad a levamisol, características que se ven atenuadas en células TNAP+/-. El hecho de que el tratamiento con 3 inhibidores de TNAP diferentes reproduzca la menor producción de citoquinas y de respuesta proliferativa, así como una resistencia a la inhibición por levamisol observada en células T de TNAP+/- claramente sugiere que el fenotipo sensible a levamisol es el necesario para que se de una correcta y completa activación de las células T. 5. CONCLUSIONES 1. La falta de un alelo de Alpl no altera en general la actividad AP en distintos tejidos (medida utilizando p-nitrofenilfosfato como sustrato), pero sí altera la sensibilidad enzimática in vitro al inhibidor específico levamisol, lo que sugiere cambios en el patrón de glicosilación de la enzima. 2. La TNAP modula la función de los linfocitos T, siendo necesaria para su completa activación. Tanto en células T de ratones heterocigotos para Alpl, activadas por anticuerpos anti-CD3ε/anti-CD28, como en células T tratadas con inhibidores específicos de la enzima hemos descrito una disminución de la producción y liberación de citoquinas proinflamatorias y la reducción de la respuesta proliferativa. La importancia de la TNAP en la función de los linfocitos T ha sido puesta de manifiesto asimismo in vivo, incluyendo una respuesta inflamatoria atenuada en el modelo de colitis crónica por transferencia linfocitaria. 3. Hemos relacionado las alteraciones en la activación de células T con la regulación de la TNAP mediante modificaciones transcripcionales y postranscripcionales (cambios en la glicosilación de la enzima), lo que introducen nuevas posibilidades en el manejo de la inflamación. REFERENCIAS: 1. Millán, J.L., Mammalian alkaline phosphatases: from biology to applications in medicine and biotechnology. Gene Structure. 2006. 2. Matsuura, S., F. Kishi, and T. 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