Materiales inorgánicos porosos para la liberación controlada de monóxido de carbono con fines terapéuticos

Resumen

RESUMEN Uno de los mayores retos científicos del siglo XXI es el diseño de materiales avanzados que puedan actuar como sistemas multifuncionales. Por ejemplo, en el ámbito de la biomedicina, se persigue el desarrollo de materiales inteligentes que sean capaces de actuar, al mismo tiempo, como vehículos para el transporte de fármacos de índole diversa y como sistemas de liberación controlada de los mismos. Estos híbridos fármaco@material presentarían, además, numerosas ventajas respecto a la simple administración del fármaco original; entre otras, i) un aumento en la eficacia terapéutica del principio activo, ii) un incremento en la estabilidad del fármaco en medio fisiológico, iii) una mayor especificidad del tratamiento y iv) una disminución de los efectos secundarios adversos. Aunque ya se ha explorado la potencialidad de una amplia variedad de materiales (liposomas, micelas orgánicas, nanopartículas inorgánicas o materiales inorgánicos porosos), como sistemas para el transporte y liberación de fármacos (DDS, del inglés drug delivery system), aún queda mucho por hacer. En este contexto, esta Tesis Doctoral quiere aportar nuevos estudios acerca del uso de algunos materiales inorgánicos porosos, en concreto, los polímeros de coordinación porosos o redes metalorgánicas (PCPs o MOFs, del inglés Metal-Organic Frameworks) y las sílices mesoporosas (SMPs), como DDS. Los MOFs son compuestos híbridos metal-orgánicos cristalinos, que presentan un tamaño de poro homogéneo (en el orden de los microporos o de los mesoporos), mientras que las SMPs son sólidos constituidos por SiO2 que se ordenan generando cavidades de tamaño homogéneo en el orden de los mesoporos. Ambos materiales poseen interesantes características que los hace candidatos idóneos para el desarrollo de nuevos DDS, entre otras: i) elevada área superficial, ii) gran volumen de poro y iii) fácil funcionalización. Por otra parte, el monóxido de carbono es un gas incoloro e inodoro que se produce como consecuencia de la oxidación parcial de compuestos de carbono. Su elevada toxicidad en animales y humanos, debida a su mayor afinidad por la hemoglobina frente al oxígeno, le ha otorgado el apelativo de “asesino silencioso”, ya que su inhalación en altas concentraciones puede causar importantes lesiones, incluida la muerte. Sin embargo, este gas también se produce de forma endógena, en el organismo de mamíferos, a través de la acción de la enzima hemoxigenasa, cuya expresión es estimulada como respuesta ante diferentes situaciones de estrés. En este contexto, numerosos estudios han puesto ya de manifiesto la potencialidad de este gas como agente terapéutico, al demostrar su efectividad frente a diversos modelos de enfermedad. En concreto, la primera vía de administración de CO exógeno que se ha propuesto es la inhalación directa de mezclas aire-CO con la proporción adecuada de la molécula bioactiva. A pesar de la sencillez aparente de este protocolo/dispositivo, esta vía de administración presenta una seria limitación: la falta de especificidad. Así, la biodistribución del CO depende del coeficiente de partición entre los diferentes tejidos y fluidos corporales. En concreto, el CO inhalado accede al organismo mediante los pulmones por lo que, si son otros los órganos diana, serían necesarias mayores dosis para lograr efectos terapéuticos. Además, su liberación se produce como consecuencia de su unión reversible a la hemoglobina, por lo que su acción en órganos y tejidos lejanos al sistema vascular es muy limitada. Por este motivo, en el año 2001, el grupo del Prof. Motterlini planteó por primera vez el empleo de moléculas liberadores de CO (CORMs, del inglés CO-Releasing Molecules), como una estrategia alternativa para una administración más específica de este gas terapéutico. Estos compuestos, que generalmente son carbonilos metálicos y pueden considerarse profármacos de CO, permiten la liberación controlada de la molécula bioactiva (CO) como respuesta a un estímulo externo (luz, temperatura, campo magnético) o a un efecto fisiológico (cambio de pH, interacción con enzimas). Sin embargo, la implementación clínica de los CORMs se ve limitada debido a su baja estabilidad en medios fisiológicos, a la toxicidad asociada a las fracciones metálicas de decarbonilación (iCORMs), así como a los rápidos perfiles de liberación de CO que presentan. Con el objetivo de superar estas limitaciones, han surgido recientemente un nuevo tipo de materiales multitarea e inteligentes conocidos como CORMAs (materiales liberadores de CO, del inglés CO-Releasing Materials). Estos sistemas son plataformas de almacenamiento de monóxido de carbono (obtenidos mediante la unión de un CORM a un sistema macromolecular) capaces de liberar el CO de forma activa como respuesta ante un estímulo específico (sistemas inteligentes ON/OFF). Además, también son capaces de evitar/minimizar la lixiviación indeseada de los fragmentos metálicos (CORMs e iCORMs) en el organismo, con el consiguiente beneficio para el paciente. Bajo este telón de fondo, en esta Tesis Doctoral, se han preparado y caracterizado nuevos materiales liberadores de monóxido de carbono mediante la combinación de dos CORMs fotoactivos y diferentes materiales inorgánicos porosos (MOFs y SMPs). Algunos de los nuevos materiales híbridos desarrollados i) mantienen las propiedades fotoactivables del CORM original, ii) ofrecen perfiles cinéticos de liberación más favorables, es decir, más controlados en el tiempo y iii) son capaces de retener, en el interior de sus cavidades, la mayor parte de los fragmentos metálicos, limitando, de esta forma, su potencial toxicidad. En concreto, en el Capítulo II de esta Tesis Doctoral, se describe la preparación de dos nuevos CORMAs basados en la encapsulación del tricarbonilo de molibdeno biológicamente activo [Mo(CNCMe2CO2H)3(CO)3] (CNCMe2CO2H = 2-isociano-2-metilpropanoico), conocido como ALF794, dentro de las cavidades de diferentes materiales mesoporosos del tipo [Al(OH)(SDC)] (H2SDC: ácido 1,2-difeniletilenil-4,4’-dicarboxílico), conocido como CYCU-3. Para ello, en primer lugar, se ha estudiado la influencia que tiene la concentración de los reactivos, así como la proporción de modulador (ácido acético)/ligando empleada, sobre las características finales (tamaño, morfología y cristalinidad) de los materiales CYCU-3 preparados. En relación a los reactivos, se ha observado que el empleo de concentraciones diluidas, en ausencia de modulador (CYCU-3 20_0, concentración de reactivos 20 mM, proporción ligando/modulador 1/0), conduce a la formación de nanopartículas pseudoesféricas (~100 nm) con baja cristalinidad; mientras que el empleo de mezclas más concentradas (30-60 mM) permite la obtención de materiales más cristalinos pero con partículas alargadas en el rango de las micras. Por otra parte, en lo que respecta a la proporción ligando-modulador, se ha demostrado que un incremento en la concentración de ácido acético en el medio de reacción (proporción molar ligando-modulador usadas: 1/5 a 1/50), provoca un aumento en la longitud de las partículas resultantes. Además, para el caso de los materiales preparados con una proporción molar ligando/modulador 1/50, y en concreto para el material CYCU-3 50_50 (concentración de reactivos 50 mM, proporción molar ligando/modulador 1/50), se ha observado la formación de una nueva fase cristalina, para la que se ha propuesto un modelo estructural basado en una estructura distorsionada del material CYCU-3 original. Con el objetivo de estudiar la potencialidad de estas matrices como vehículos para el transporte y liberación del CORM fotoactivo ALF794, se han seleccionado tres de los materiales preparados. Las matrices seleccionadas (CYCU-3 20_0, CYCU-3 50_5 y CYCU-3 50_50) presentan tamaños de partícula y morfología muy diferentes entre sí. Antes de llevar a cabo la encapsulación del CORM ALF794, se ha analizado la estabilidad térmica y la porosidad de dichas matrices. En concreto, los materiales CYCU-3 20_0 y CYCU-3 50_5 muestran una elevada porosidad, con superficies de BET de 2225 m2g-1 y 2575 m2g-1, respectivamente. En lo relativo a su estabilidad térmica, el material CYCU-3 20_0 es menos estable que el CYCU-3 50_5 (temperatura de descomposición de 350 ºC y 408 ºC, respectivamente) probablemente debido a su menor cristalinidad y tamaño de partícula. Por otro lado, el material CYCU-3 50_50 presenta una menor capacidad de adsorción que los materiales anteriores (SBET de 865 m2g-1), pero una mayor estabilidad térmica (temperatura de descomposición: 473 ºC). Para explicar este comportamiento tan diferente, se ha propuesto que 2/3 de sus cavidades están ocupadas por cadenas monodimensionales del tipo [Al(OH)(CH3COO)2]n. Esta ocupación parcial de los poros explica la importante disminución en la capacidad de adsorción para este material, así como su mayor estabilidad térmica y mecánica, al tratarse de un material más compacto que los anteriores. A continuación, se ha llevado a cabo la incorporación del tricarbonilo metálico ALF794 en los materiales descritos anteriormente mediante un proceso de impregnación sólido-líquido asistido por la eliminación progresiva del disolvente. Los resultados demuestran que la matriz CYCU-3 50_50 es capaz de incorporar 0.71 mmol de CORM por gramo de material, mientras que la matriz CYCU-3 50_5 tan solo incorpora 0.44 mmol de CORM por gramo de material. Los resultados indican que la presencia de un mayor número de defectos cristalinos en la red deformada del CYCU-3 50_50 facilita la difusión del CORM ALF794 hacia el interior de los canales monodimensionales, haciendo más efectiva su encapsulación. Además, el mayor volumen de poro ocupado en este sistema (52.4 %) en comparación con el material ALF794@CYCU-3 50_5 (11.5 %), está de acuerdo con la presencia de asociaciones de moléculas de ALF794 que interaccionan por enlaces de hidrógeno lo que favorece su retención dentro de la matriz porosa. Por otro lado, se ha comprobado que la matriz CYCU-3 20_0 se degrada parcialmente en las condiciones de encapsulación, descartándose como potencial CORMA. En referencia a los estudios de liberación de monóxido de carbono, los resultados confirman, en primer lugar, que el ALF794 es un compuesto fotoactivo bajo irradiación con luz visible, liberando 0.7 mmoles de CO por mmol de ALF794 a las 24 horas. En relación a los sistemas híbridos (ALF794@CYCU-3 50_5 y ALF794@CYCU-3 50_50), se ha demostrado que estos sistemas liberan CO de forma más controlada que el CORM libre. En concreto, se ha observado que, tras 24 horas, ALF794@CYCU-3 50_5 libera el doble de CO (0.46 mmol de CO por mmol de ALF794) que ALF794@CYCU-3 50_50 (0.24 mmol de CO por mmol de ALF794). Sin embargo, el material CYCU-3 50_5 tiene poca capacidad para retener en su matriz los fragmentos metálicos (6 % de Mo retenido tras 6 horas de irradiación con luz visible), probablemente como consecuencia de su baja estabilidad en PBS, lo que parece indicar que la liberación de CO observada (0.46 mmol de CO por mmol de ALF794) se debe principalmente a la fotoactivación de las moléculas de ALF794 lixiviadas al medio. Por el contrario, la matriz CYCU-3 50_50 muestra una mayor capacidad para retener los fragmentos metálicos (75 % de Mo retenido tras 72 horas de incubación en PBS), lo que sugiere que, en este caso, la liberación de CO observada se debe principalmente a la fotoactivación de las moléculas de ALF794 que permanecen adsorbidas dentro de la matriz porosa. De hecho, esta mayor estabilidad en PBS, y la consiguiente capacidad para retener los fragmentos metálicos dentro de la matriz, parece estar relacionada con la menor exposición de los centros metálicos del MOF al medio, debido a la presencia de las cadenas de [Al(OH)(CH3COO)2]n, y con el mayor grado de ocupación de los poros, que favorecería la retención de las moléculas del CORM al establecerse interacciones por enlaces de hidrógeno. Por otra parte, en el Capítulo III de esta Tesis Doctoral, se estudia la preparación de nuevos materiales liberadores de monóxido de carbono basados en la combinación del mismo fotoCORM utilizado en el Capítulo II (ALF794), con el polímero de coordinación poroso de estructura jerarquizada [Zn2(dhtp)(H2O)2] (H4dhtp: ácido 2,5-dihidroxitereftálico), conocido como Zn-MOF-74 o ZnCPO. Aunque el material poroso seleccionado es biocompatible, desafortunadamente no presenta mesoporosidad intrínseca, lo que dificultaría enormemente la difusión de las moléculas de CORM hacia el interior de sus cavidades y, por tanto, su encapsulación. Por este motivo, y con el objetivo de conseguir un material que también sea mesoporoso, se ha empleado la metodología conocida como “nanofusión por pertubación”. Esta estrategia de síntesis permite la creación de mesoporos, en un material inicialmente microporoso, al favorecer la condensación/agregación controlada de nanopartículas cristalinas del MOF frente al proceso de cristalización. Mediante un control adecuado de las condiciones experimentales, estos agregados de nanopartículas pueden crear entre sí intersticios, ordenados a lo largo del espacio, con un tamaño en el rango de los mesoporos y accesibles a moléculas huésped de mayor tamaño. Una vez sintetizada la matriz mediante esta novedosa estrategia y con el objetivo de examinar su potencial uso en aplicaciones biomédicas, se ha analizado su estabilidad química en dos tampones fisiológicos diferentes: HEPES (10 mM, pH 7.4) y PBS (10 mM, pH 7.4). Los resultados han demostrado que la matriz porosa de estructura jerarquizada ZnCPO presenta una baja estabilidad en PBS, probablemente debido a la formación de fosfatos de zinc, mientras que es relativamente estable en HEPES (tanto los difractogramas de rayos X en polvo como los espectros infrarrojos de los sólidos recogidos, tras 6 horas de incubación en HEPES a 37 °C, muestran los picos/bandas características para la matriz ZnCPO). Además, y con el objetivo de minimizar el tiempo de preparación del CORMA, la incorporación del ALF794 se ha llevado a cabo durante la propia síntesis del material poroso, siendo el primer ejemplo de CORMA, basado en materiales inorgánicos porosos, que se prepara en una única etapa. Esta estrategia de síntesis-encapsulación en un solo paso supone una ventaja significativa frente a la metodología convencional de incorporación de moléculas huésped en sólidos porosos desarrollada por ejemplo en el Capítulo II, ya que disminuye el número de etapas necesarias, los requerimientos energéticos del proceso, el tiempo de operación/manipulación, así como el riesgo de degradación o fotoactivación involuntaria del CORM. Para optimizar la cantidad de ALF794 empleada durante el proceso de síntesis-encapsulación, se han utilizado diferentes proporciones molares ALF794/Zn(AcO)2•2H2O. Los resultados demuestran que el uso de menores proporciones de CORM proporciona encapsulaciones más eficientes (el porcentaje de CORM encapsulado respecto al CORM empleado es mayor) y materiales más cristalinos y puros (ausencia de óxidos de molibdeno como subproductos). A la vista de estos resultados, el sistema híbrido más prometedor es el material ALF794@ZnCPO_0.2 (proporción molar ALF794/Zn(AcO)2•2H2O = 0.2), con una encapsulación de 0.28 mmol de CORM por gramo de material. En relación a los estudios de liberación de CO, el sistema híbrido ALF794@ZnCPO_0.2 exhibe, tras su fotoactivación con luz visible, una tasa de liberación de CO muy limitada (0.05 mmol de CO por mmol de complejo para una concentración de ALF794 cinco veces mayor a la ensayada para el resto de sistemas). En contraposición, bajo una radiación más energética (luz ultravioleta, λ = 365 nm), el material cargado es capaz de liberar satisfactoriamente CO, con un perfil de liberación más controlado (0.33 mmol de CO liberados por mmol de CORM encapsulado tras 180 minutos de irradiación) que el del CORM original (0.95 mmol de CO liberados por mmol de CORM encapsulado tras 150 minutos de irradiación). Por último, los estudios de ICP-OES corroboran, tanto en oscuridad como bajo irradiación con luz ultravioleta, la elevada estabilidad de la matriz porosa en HEPES (lixiviando tan solo un 9 % de zinc tras 6 horas de incubación) y su capacidad para minimizar los fragmentos metálicos (CORMs e iCORMs) liberados al medio (aprox. 17 % de Mo, tras 6 horas de incubación). Por último, el Capítulo IV de esta Tesis Doctoral se centra en la preparación y caracterización de diferentes materiales liberadores de monóxido de carbono basados en materiales inorgánicos porosos (sílices mesoporosas y redes metalorgánicas) y el tricarbonilo de manganeso [Mn(tacn)(CO)3]Br (tacn = 1,4,7-triazaciclonano), conocido como ALF472. En este caso, y a diferencia de los capítulos anteriores donde la preparación de los sistemas híbridos CORM@MOFs se basaba en fenómenos de fisisorción, los potenciales CORMAs de este capítulo se han preparado mediante una estrategia de intercambio iónico. Por tanto, se espera que las interacciones anfitrión-huésped sean más fuertes (gracias a las interacciones electrostáticas), lo que puede influir en la cantidad de fármaco incorporado, en el perfil cinético de liberación del CO y en la retención de los fragmentos metálicos encapsulados en las cavidades. El primer material con el que hemos trabajado es el polímero de coordinación poroso (NH2(CH3)2)2[Zn8(adeninato)4(BPDC)6] (BPDC: ácido bifenil-4,4’-dicarboxílico), conocido como bio-MOF-1. Este MOF presenta un esqueleto de naturaleza aniónica, lo que permite la encapsulación del compuesto catiónico ALF472+ en su matriz porosa, con una eficiencia de intercambio del 35 % (0.25 mmol de ALF472 por gramo de material). Los estudios de liberación de CO para el complejo ALF472 demuestran que este CORM es fotoactivo, ya que solo libera CO en presencia de luz visible (0.80 mmol de CO por mmol de ALF472 tras 24 horas de incubación), permaneciendo inactivo en oscuridad. Por su parte, el sistema híbrido ALF472@bio-MOF-1 muestra una capacidad total de liberación de CO similar a la del CORM original (0.82 mmol de CO por mmol de ALF472 tras 24 horas de incubación), pero lo hace a una mayor velocidad, como se pone de manifiesto en la pendiente más abrupta del perfil cinético. Este hecho experimental anómalo puede ser explicado en base a la baja estabilidad del polímero de coordinación poroso en medio fisiológico, que se degrada casi por completo en el transcurso de 6 horas. La lixiviación de sus componentes al medio fisiológico, y en concreto de la adenina, como consecuencia de la degradación de la matriz, parece favorecer la disociación del enlace Mn-CO, acelerando la liberación de la molécula bioactiva. Debido a la baja estabilidad del material híbrido preparado anteriormente, se ha llevado a cabo la preparación de dos nuevos CORMAs basados en el mismo CORM catiónico (ALF472+) y las sílices mesoporosas MCM-41 y SBA-15, que muestran una mayor estabilidad en medio fisiológico. En este caso, se llevó a cabo la funcionalización post-sintética de estas matrices con grupos alquilsulfónicos para conferir carácter aniónico a sus cavidades. Una vez aisladas las sílices funcionalizadas, al igual que en los casos anteriores, se procedió a incorporar el ALF472 mediante intercambio iónico. Así pues, las eficiencias de intercambio han sido del 100 % para la sílice funcionalizada MCM-41-SO3H (con 0.22 mmol ALF472 por gramo de material) y del 50 % para la SBA-15-SO3H (con 0.53 mmol ALF472 por gramo de material), mientras que no se ha observado intercambio alguno para los materiales originales sin funcionalizar. En lo relativo a los estudios de retención de los fragmentos metálicos en PBS, los resultados han demostrado que, aunque ambas matrices poseen una elevada estabilidad en dicho medio fisiológico, los dos sistemas híbridos intercambian la mayor parte de las moléculas de ALF472+ encapsuladas por cationes presentes en el tampón PBS (85 % de lixiviación de Mn para ALF472@MCM-41-SO3 tras 1 hora de incubación y 75 % para ALF472@SBA-15-SO3 tras 24 horas de incubación en oscuridad). Por último, los estudios de liberación de CO han puesto de manifiesto que los materiales híbridos presentan perfiles cinéticos similares al CORM original, lo que sugiere, una vez más, que la liberación de CO observada se debe, fundamentalmente, a las moléculas de CORM lixiviadas al medio. Debido a la baja capacidad que estas sílices funcionalizadas tienen para almacenar el CORM en presencia de altas concentraciones de sales (como es el caso de los medios fisiológicos), hemos explorado el uso de la sílice mesoporosa funcionalizada Al-MCM-41 como un sistema anfitrión alternativo. El dopaje con grupos aluminato de la sílice mesoporosa MCM-41 tiene como objetivo conseguir interacciones electroestáticas huésped-anfitrión más fuertes que las presentes en los casos anteriores, que impliquen una menor lixiviación de los fragmentos metálicos, potencialmente tóxicos, en el medio fisiológico. De esta forma, se ha preparado el material ALF472@Al-MCM-41 con una gran eficiencia de encapsulación (0.48 mmol ALF472 por gramo de material). Este material presenta además una elevada estabilidad en medio fisiológico así como una mayor capacidad de retención de los fragmentos metálicos (capacidad de retención del 86 % de ALF472 tras 6 días de incubación en PBS, a 37 ºC, en oscuridad) que las sílices con grupos alquilsulfónicos. Además, el material ALF472@Al-MCM-41 presenta un perfil de la cinética de liberación de CO completamente diferente al CORM libre, mostrando una liberación de CO más controlada en el tiempo y una cantidad total de CO liberado de 0.28 mmol de CO por mmol de CORM encapsulado. Por tanto, en este caso, la liberación de CO se produce, principalmente, a partir de las moléculas de ALF472 adsorbidas en la matriz. Por último, es importante destacar, que a diferencia de los CORMAs mencionados anteriormente, el sistema ALF472@Al-MCM-41 está constituido por partículas de tamaño nanométrico, cuyas suspensiones son estables en PBS y que, por tanto, son adecuadas para una potencial administración intravenosa. Finalmente, como prueba de concepto, se ha llevado a cabo satisfactoriamente la incorporación simultánea y eficiente de dos metalodrogas de referencia (ALF472 y cisplatino) en la matriz porosa Al-MCM-41 (ALF472: 0.45 mmol g-1, cisplatino: 0.12 mmol g-1). El nuevo sistema dual presenta una retención de los CORMs e iCORMs similar a la observada para el sistema híbrido ALF472@Al-MCM-41. Sin embargo, cabe mencionar que su capacidad para liberar CO bajo activación con luz visible (0.11 mmol de CO por mmol de ALF472 encapsulado) disminuye con respecto al material que sólo encapsula el CORM (ALF472@Al-MCM-41). Con el objetivo de lograr una liberación de CO más eficiente, el material dual se ha irradiado también con luz ultravioleta, consiguiendo liberar 0.59 mmol de CO por mmol de CORM encapsulado tras 2 horas de incubación. Aunque la irradiación con luz ultravioleta mejora la cantidad total de CO liberado, el sistema presenta una tasa de liberación de cisplatino baja (8.8 % tras 48 horas de incubación) lo que probablemente conlleve una baja actividad antitumoral de este sistema dual. En definitiva, durante la realización de esta Tesis Doctoral se ha demostrado que es posible la preparación de nuevos materiales liberadores de monóxido de carbono (CORMAs) basados en polímeros de coordinación porosos o sílices mesoporosas y moléculas liberadoras de monóxido de carbono. Algunos de los CORMAs preparados presentan propiedades mejoradas respecto a los CORMs originales, puesto que ralentizan la liberación de CO y minimizan la lixiviación de fragmentos metálicos (CORMs e iCORMs), potencialmente tóxicos, al medio fisiológico. Por último, se ha llevado a cabo la encapsulación dual del agente antitumoral cisplatino y del fotoCORM ALF472 en una de las sílices mesoporosas, lo que representa una prueba de concepto de la posibilidad de desarrollar CORMAs avanzados con actividad terapéutica dual.