Nuevos marcadores genéticos de predisposición a la enfermedad inflamatoria intestinal

Resumen

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), es una patología que engloba dos enfermedades principales, la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU). En la actualidad se enmarca dentro de las denominadas enfermedades genéticas comunes complejas. La complejidad viene determinada por la intrincada relación entre factores ambientales y genéticos que desemboca en una inapropiada respuesta del sistema inmunológico, responsable del daño ocasionado en los tejidos y órganos afectados. Por el momento los factores ambientales implicados son poco conocidos, salvo el tabaco que tiene efectos contrapuestos, siendo beneficioso en la colitis ulcerosa y perjudicial en la enfermedad de Crohn. El resto, tales como dieta, polución, estrés, entre otros, aún no están bien determinados. Con respecto a los factores microbianos, no se ha podido encontrar un agente causal responsable de la enfermedad a pesar de los numerosos candidatos propuestos, Micobacterium avium paratuberculosis (MAP), Paramixovirus, Escherichia coli, etc... Por último, los factores genéticos han sido la fuente de conocimiento que más luz ha aportado en los últimos años a la patogenia de la enfermedad, abriendo incluso el camino hacia nuevas vías fisiopatológicas hasta el momento no relacionadas con la enfermedad inflamatoria intestinal, como es el caso del reciente descubrimiento de la importancia de la autofagia. La historia de la genética moderna en la enfermedad inflamatoria intestinal comienza en el año 2001 cuando se descubrió la implicación del gen nucleotide-binding oligomerization domain containing 2 (NOD2/CARD15) en la enfermedad de Crohn, hecho que supuso la primera evidencia contrastada de cómo una serie de variantes genéticas estan asociadas a la enfermedad. En este momento ya se han descrito los mecanismos moleculares subyacentes a la asociación de NOD2/CARD15 con la enfermedad de Crohn. NOD2/CARD15 es un receptor de patógenos intracelular relacionado con la destrucción de bacterias de la luz intestinal por parte de los monocitos. Las tres variantes localizadas en el gen NOD2/CARD15 impiden que se realice una respuesta inmunológica apropiada que termina por destruir los tejidos propios. Los polimorfismos del gen NOD2/CARD15 no son suficientes para explicar la totalidad del componente genético de la enfermedad de Crohn. Hasta el momento se han localizado 9 regiones cromosómicas candidatas y dentro de ellas se han localizado algunos polimorfismos de genes también implicados en la enfermedad de Crohn, aunque al igual que el gen NOD2/CARD15 contribuyen de forma modesta al desarrollo de la enfermedad y se sigue sin conocer de forma completa el riesgo genético que posee un individuo a padecer la enfermedad inflamatoria intestinal. Por lo tanto se hace necesario profundizar en la arquitectura genética de esta patología que ayude a elucidar los mecanismos moleculares de la misma, lo cual podría contribuir a la mejora en el diagnóstico y al desarrollo de nuevas dianas terapéuticas. Bajo estas premisas, el objetivo de este trabajo ha sido contribuir en la identificación de nuevos marcadores genéticos asociados a la susceptibilidad/protección de la enfermedad inflamatoria intestinal. Para realizar dicho objetivo se ha seguido una estrategia basada en la realización estudios de asociación caso control de genes candidatos seleccionados según su implicación funcional en la fisiopatología de la enfermedad inflamatoria intestinal. Dentro de la gran panoplia de moléculas relacionadas con la inflamación se seleccionaron los genes NFKB1(factor de transcripción nuclear kappa B1) por ser uno de los principales factores de transcripción que regulan genes proinflamatorios y FOXP3 (forkhead box P3) clave para el desarrollo y actividad funcional de linfocitos T reguladores. El gen PTPN22 (protein tyrosine phosphatase N22) es una fosfatasa específica de linfocitos implicada en la señalización a través del receptor de las células T (TCR) y asociada a numerosas patologías autoinmunes. Los genes NOS2A y NOS3 que codifican para las óxido nítrico sintasas inducible y endotelial respectivamente fueron seleccionadas por el papel que juega el óxido nítrico (ON) en la patología, ya que contribuye al estrés oxidativo y por los elevados niveles de ON observados en los pacientes de enfermedad inflamatoria intestinal. El gen del factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) se seleccionó debido a su capacidad pleiotrópica, al ser una citoquina proinflamatoria con actividad neuroinmunomoduladora y a su implicación en modelos animales de enfermedad inflamatoria intestinal. Para el estudio de la vía de la IL-23 se seleccionó el gen IL23R recientemente identificado como un gen asociado a la enfermedad inflamatoria intestinal en otras poblaciones, poniendo así de manifiesto la importancia de las células proinflamatorias Th17. Por último se seleccionó el gen de la miosina 9b (MYO9B) relacionado con la integridad de la barrera epitelial, siendo este el primer mecanismo de defensa del organismo frente a patógenos y asociado previamente a la enfermedad celíaca, otra enfermedad en la que la integridad de la barrera está alterada. Para realizar los análisis se ha recopilado una larga cohorte de pacientes de enfermedad inflamatoria intestinal provenientes del Hospital Virgen de las Nieves de Granada y eventualmente se ha contado con una segunda y tercera cohorte del Hospital Puerta del Mar (Cádiz) y Hospital Clínico San Carlos (Madrid). Los individuos control fueron obtenidos de los bancos de sangre de las ciudades indicadas. Tras la extracción de ADN de las muestras se diseñaron diferentes estrategias de tipaje para los polimorfismos estudiados, desde PCR-RFLP hasta PCR a tiempo real. Tras el recuento de los tipajes en pacientes y controles se procedió al análisis estadístico de los mismos, principalmente mediante la prueba ¿2 de Pearson. Para evaluar el riesgo genético se utilizó la razón de productos cruzados odds ratio (OR). En los casos en los que fue necesario construir haplotipos, éstos fueron realizados mediante los Softwares Unphased y Haploview. Nuestros resultados indican que el gen MIF está relacionado con la susceptibilidad genética a la enfermedad inflamatoria intestinal, tanto para la enfermedad de Crohn como para la colitis ulcerosa. El alelo MIF -173*C confiere riesgo genético a padecer la enfermedad, incrementándose este cuando el alelo se presenta en homocigosis. También se observó que variantes del gen IL23R confieren protección genética a la enfermedad inflamatoria intestinal de forma independiente. Esto indica la importancia de los distintos mecanismos de regulación y expresión de este receptor. El polimorfismo más fuertemente asociado es el rs1478026 que provoca un cambio de aminoácido arginina por glutámico pudiendo afectar a la conformación y función de la proteína de forma severa. Por último, los polimorfismos del gen MYO9B resultaron asociados de forma exclusiva a la colitis ulcerosa apoyando así la hipótesis de que ambas enfermedades comparten un origen genético común pero que existen otros genes que las diferencian. El resto de variantes genéticas analizadas reveló que los genes candidatos NOS2A, NOS3, NFKB1, PTPN22 y FOXP3 no parecen desempeñar un papel relevante en la predisposición genética a la enfermedad inflamatoria intestinal. Los resultados obtenidos en nuestro trabajo, junto con los datos aportados por el resto de la comunidad científica, están contribuyendo al avance del conocimiento de los factores genéticos que determinan el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal, aunque aún queda mucho camino por recorrer para poder conocer con exactitud cuántos genes y en que proporción están implicados en la patología. El futuro de la genética aplicada a las enfermedades comunes pasa por los esfuerzos en la recolección de un mayor número de muestras, para así aumentar el poder estadístico de los estudios y por ende la fiabilidad de los resultados. De esta forma se pueden identificar variantes cuyas frecuencias alélicas estén por debajo del 5%, hecho hasta ahora difícil de observar en los estudios presentes. Junto con el aumento del tamaño muestral, el desarrollo de plataformas de genotipado a gran escala, que permiten el rastreo simultáneo de un gran número de marcadores de todo el genoma, abren nuevos caminos para la identificación de los factores genéticos responsables de las enfermedades autoinmunes complejas como la enfermedad inflamatoria intestinal. Esta nueva aproximación utilizando rastreos mediante SNPs del genoma total (genome wide association studies, GWAs), ya está dando sus primeros frutos, así recientemente se han determinado nuevos genes tales como IL23R y ATG16L1, implicados de forma sólida en la predisposición a la enfermedad inflamatoria intestinal.