Técnicas de imagen y proteómicas aplicadas al seguimiento de la interacción virus-planta huésped

Resumen

Trabajos previos de nuestros grupo han demostrado que la Infección por el virus del moteado suave del pimiento (PMMoV) en Nicotiana benthamiana induce un descenso en los niveles de proteínas de la cadena transportadora de electrones y del ciclo de Calvin, así como cambios en la expresión de diversos genes de proteínas del cloroplasto, tanto de codificación nuclear como cloroplastídica. Las medidas de termoluminlscencia mostraron alteraciones en el lado donador del PSII y en el potencial asimilatorio, la inducción de un transporte cíclico de electrones en torno al PSI para atender una mayor demanda de ATP en las plantas infectadas y la presencia de estrés oxidativo. Las técnicas de captación de imágenes de fluorescencia roja emitida por la clorofila demostraron ser de utilidad para realizar un seguimiento de la infección por este tobamovirus y de los mecanismos de defensa que el cloroplasto desarrolla durante la patogénesis. Continuando con estos trabajos, en la presente Tesis Doctoral hemos utilizado tres técnicas biofísicas de captación de imágenes para estudiar el estrés causado por PMMoV en Nicotiana benthamiana. (i) La termografía de imagen permitió el seguimiento de los cambios en el patrón de transpiración de las hojas mediante la visualización de los cambio de temperatura en su superficie. Hemos demostrado que las plantas infectadas sufrían un incremento progresivo de temperatura en las hojas asintomáticas, que afectaba primero a las venas principales y se extendía posteriormente al resto del limbo foliar; este fenómeno precedía a la entrada del virus en este tipo de hojas. En las hojas sintomáticas, el incremento de temperatura era homogéneo y no progresivo, siendo posterior a la aparición de síntomas. En ambos casos, este aumento de temperatura se correlacionó con un descenso de la transpiración de la hoja ocasionado por el cierre estomático inducido por la infección viral. Las medidas de fluorescencia roja de la clorofila de imagen, simultáneas a las térmicas, mostraron que las alteraciones en el patrón de emisión de fluorescencia se correlacionan con la distribución del virus en las hojas asintomáticas. (ii) Las técnicas de imagen de captación de fluorescencia inducida por luz UV han registrado un aumento de la fluorescencia verde y azul, muy acentuado en la cara abaxial de las hojas de plantas infectadas. Asimismo, el análisis por HPLC de extractos de hoja nos ha permitido establecer que la sustancia responsable de este aumento de fluorescencia verde y azul en las plantas infectadas es el ácido clorogénico. Los cocientes de fluorescencia F440/F690 y F440/F740 han demostrado además ser adecuados para el seguimiento de la infección viral tanto en la cara adaxial como abaxial de las hojas, (iii) Las técnicas de Imagen de detección de la fluorescencia roja de la clorofila nos han demostrado que, incluso en ausencia de síntomas, el NPQ es un buen indicador de la infección viral. Utilizando métodos estadísticos avanzados, hemos conseguido encontrar parámetros obtenidos a partir de la cinética de inducción de la fluorescencia que, a diferencia de los parámetros convencionales, no reflejan ningún proceso fisiológico, pero sus imágenes permiten un seguimiento de la infección con PMMoV y la detectan antes de la entrada del virus en las hojas asintomáticas. La última parte del presente trabajo, continúa con la aproximación proteómica al cloroplasto de Nicotiana benthamiana y el análisis de los cambios que el virus induce en el mismo. Los geles bidimensionales, realizados en este caso en el rango de pH 6-11, nos han permitido ampliar el número de proteínas identificadas en el proteoma del cloroplasto de la planta huésped, y comprobar cómo la infección por PMMoV lleva a un incremento o descenso en los niveles de expresión de algunas de ellas.