Interactions involved in the permeation and distribution of ions and biomolecules inside charged microgels

Resumen

1. Introducción Hablamos de microgel para referirnos a una "suspensión coloidal de partículas de gel" [1]. Es decir, son partículas porosas formadas por cadenas de polímero entrecruzadas dispersas en un disolvente. Es frecuente denominarlas también nanogeles [2], pues su diámetro oscila entre los 10 y los 1000 nm, o hidrogeles, cuando se encuentran dispersas en agua. La principal característica de los microgeles es que pueden absorber grandes cantidades de disolvente, provocando drásticos cambios en su tamaño, en respuesta a un gran número de estímulos tales como temperatura, pH, concentración salina, luz, campos externos o solutos específicos como glucosa u otras biomoléculas [3-8]. Gracias a esta versatilidad se dice que los microgeles son materiales "inteligentes". La capacidad para responder a estímulos externos unida a su tamaño coloidal les permite formar diferentes estructuras con numerosas aplicaciones. Por ejemplo, el estudio de monocapas de microgeles en la interfase aire-agua [9], aceite-agua [10,11] y otras interfases 12 ha ganado interés en los últimos años. De la misma forma, otras estructuras tridimensionales, tales como cristales [13,14], láminas delgadas y multicapas [15,16] han sido investigadas por diferentes autores. En los últimos años está creciendo enormemente el interés por desarrollar nuevos sistemas de transporte y encapsulación de fármacos [17-20]. Los microgeles resultan prometedores para este cometido, pues el espacio disponible en el interior de la red polimérica permite la encapsulación de diferentes solutos tales como ADN, proteínas, péptidos y otras biomoléculas [21-25], tanto hidrófilas como hidrófobas, lo que permite mejorar su solubilidad y evitar su degradación en el organismo [26]. Asimismo, la capacidad de los microgeles para expandirse y compactarse puede aprovecharse para absorber y liberar fármacos de manera controlada. Por estos motivos, un gran número de aplicaciones médicas y biotecnológicas para los microgeles están siendo ampliamente investigadas [27-30]. Los tipos de microgeles que más interés atraen son los microgeles sensibles a la temperatura y/o el pH. Por un lado, los microgeles termosensibles cuya temperatura de transición de volumen (VPTT) está próxima a la temperatura del cuerpo humano pueden resultar muy útiles en el campo de la medicina, mientras que para microgeles sensibles al pH la liberación y el transporte de biomoléculas se puede controlar mediante las interacciones electrostáticas [31]. Los microgeles basados en N-isopropilacrilamida, conocidos como PNIPAM, son los que más se han estudiado a lo largo de los años. Desde que fueron sintetizados por primera vez en los años 80 [32], se han publicado una gran cantidad de trabajos sobre diferentes estrategias de síntesis y caracterización [33-37]. De hecho, actualmente se considera el PNIPAM como un microgel modelo para la ciencia de polímeros en general, lo cual resulta especialmente útil para desarrollar y probar modelos teóricos y computacionales de microgeles [38-40]. Otro tipo interesante de microgel recientemente desarrollado es el PVCL, basado en N-vinilcaprolactama [41]. El potencial de estas partículas reside en su biocompatibilidad, que los hace muy apropiados para aplicaciones biomédicas. Esto supone una ventaja respecto a los microgeles de PNIPAM, en los que se ha observado una alta citotoxicidad [42,43]. La mayoría de microgeles diseñados con aplicaciones biotecnológicas son microgeles iónicos, es decir, poseen carga eléctrica debido a los polielectrolitos que forman la red polimérica. Cuando estos microgeles cargados se encuentran inmersos en una solución de electrolito, los iones móviles de la sal penetran a través de los poros de las partículas y se distribuyen en torno a los microgeles, creando una doble capa eléctrica. Tanto la estructura interna como la respuesta en tamaño de estos microgeles está fuertemente ligada a la concentración de electrolito y a la valencia de los contraiones presentes en el medio [33,44-46]. La presencia de electrolito también determina la interacción efectiva entre los microgeles y otras partículas presentes en la dispersión coloidal como biomoléculas. Esto se debe al apantallamiento de la carga del microgel provocado por los contraiones que penetran a través de sus poros, los cuales pueden encontrarse en libre movimiento o bien condensados en el interior de la red de polímeros [47]. Dicho apantallamiento suele caracterizarse mediante la llamada carga efectiva del microgel, que proporciona una estimación de la carga electrostática que otra partícula del medio percibe cuando se aproxima al microgel [40,48,49]. Asimismo, si los iones disueltos en el medio presentan especificidad iónica (efectos Hofmeister), el microgel puede verse afectado por fenómenos de inversión de carga o sobrecarga [50-52]. Dado el importante papel que la presencia de electrolito juega en los cambios de volumen del microgel y en las interacciones de microgeles con otras moléculas del medio, es indispensable entender los fenómenos físicos involucrados en la distribución de iones en el interior y en torno a los microgeles. Sabemos que para solutos dispersos en el medio es la interacción coulombiana que surge a consecuencia de la carga efectiva del microgel la que controla los perfiles de densidad iónicos en torno al microgel. Sin embargo, cuando un ion intenta penetrar a través de los poros de un microgel, no sólo sufre el efecto de la interacción electrostática, sino que experimenta una exclusión de volumen debido a que las fibras de polímero ocupan un espacio que el ion no puede atravesar. Esta interacción repulsiva se conoce como interacción estérica, depende de la morfología interna de la red de polímeros y es especialmente relevante cuando el microgel se encuentra en estado compactado [40,50]. Desde que los primeros microgeles fueron sintetizados, se ha publicado un gran número de trabajos relativos a la síntesis, caracterización, modelado y aplicaciones de estas partículas. Sin embargo, sólo una pequeña fracción de ellos tienen el objetivo de estudiar desde un punto de vista teórico el comportamiento de estas partículas en presencia de otros solutos cargados. Profundizar en el conocimiento de los fenómenos físicos involucrados en la respuesta de los microgeles a los cambios en el medio y de las interacciones entre microgeles y otras partículas puede estimular el desarrollo de nuevas aplicaciones, abrir nuevas líneas de investigación y en general contribuir al avance de la ciencia de materiales en general. 2. Procedimiento La investigación desarrollada en esta tesis doctoral puede dividirse en tres partes diferenciadas. A continuación describimos brevemente los trabajos realizados en cada una de ellas. 2.1. Microgeles en disoluciones de electrolito El objetivo de los artículos I [53], II [54], III [55] y IV [56] comprendidos en esta tesis doctoral consiste en el estudio de las interacciones que intervienen en la permeación de iones en el interior de microgeles iónicos termosensibles, en el límite de dispersiones de microgeles muy diluidas. Para ello se ha hecho uso del formalismo de las ecuaciones integrales de Ornstein-Zernike, de simulaciones Monte Carlo y de Dinámica Molecular, así como de trabajos experimentales de síntesis y caracterización. El punto de partida de esta tesis ha sido el estudio del efecto de la interacción estérica en la permeación de contraiones monovalentes en el interior de microgeles, recogido en el artículo I [53]. Con este objetivo hemos desarrollado un método que combina las ecuaciones integrales de Ornstein-Zernike con simulaciones Monte Carlo y hemos comparado los perfiles de densidad iónica y la carga efectiva del microgel obtenidos mediante ambos métodos para distintos estados de compactación del microgel. Este análisis nos ha permitido probar dos modelos diferentes para la repulsión estérica microgel-ion y determinar cuál de ellos es más apropiado para cuantificar los efectos de exclusión de volumen en estos sistemas. También hemos estudiado la distribución de carga del microgel, la concentración de electrolito y el tamaño iónico. Continuando con la idea del trabajo anterior, en el artículo II [54] la técnica combinada de simulaciones Monte Carlo y ecuaciones de Ornstein-Zernike se ha usado para estudiar el hinchado y desinchado de los microgeles en respuesta a dos variables concretas. Por una parte, se ha estudiado el efecto de la valencia de los contraiones mediante el estudio de microgeles en disoluciones de electrolito 1:1 y 1:3. Por otra parte, hemos considerado dos microgeles diferentes para analizar el efecto de la carga bruta de los mismos en las transiciones de volumen y la permeación de contraiones. Para modelar la interacción estérica hemos utilizado el modelo que resultó más satisfactorio en el trabajo anterior y lo hemos comparado con otro modelo diferente. La fiabilidad del formalismo teórico de Ornstein-Zernike ha sido confirmado en la publicación III [55], en el cual hemos interpretado los resultados experimentales obtenidos para dos microgeles iónicos termosensibles distintos mediante dichas ecuaciones integrales. En este trabajo hemos medido el diámetro hidrodinámico y la movilidad electroforética de dos microgeles basados en PNIPAM y PVCL para diferentes valencias y concentraciones de electrolito. Hemos obtenido una carga efectiva experimental a partir de las medidas de movilidad y la hemos comparado con la carga efectiva teórica calculada para estos sistemas. De esta forma, hemos analizado el efecto de la valencia de los contraiones y de la concentración salina sobre la carga efectiva de los microgeles, lo que nos ha permitido obtener interesantes conclusiones sobre la permeación y condensación iónica en el interior de la red de polímeros. Para concluir con esta parte de nuestra investigación, en el trabajo número IV [56] hemos seguido un procedimiento completamente diferente a los anteriores, basado en simulaciones de Dinámica Molecular. Esta técnica permite considerar el efecto conjunto de todas las interacciones que aparecen cuando cadenas de polímero se encuentran dispersas en soluciones electrolíticas. Sin embargo, es necesario tener en cuenta que modelar de forma exacta la red polimérica de una partícula de microgel es extremadamente exigente desde el punto de vista computacional, por lo que en su lugar hemos considerado una membrana de cadenas de PNIPAM como modelo. De esta forma, en primer lugar se ha confirmado el comportamiento termosensible de estas cadenas para posteriormente sumergir la membrana en diferentes soluciones de electrolito y estudiar los correspondientes perfiles de densidad iónica tanto para estados expandidos como compactados de los polímeros. 2.2. Absorción y distribución de biomoléculas en microgeles Además de las interacciones microgel-ion, para evaluar el potencial de estas partículas como sistemas de transporte y encapsulación de fármacos en necesario profundizar en el conocimiento de las interacciones entre microgeles y biomoléculas. Con este objetivo, en el artículo V [57] hemos dejado a un lado el formalismo integral y las simulaciones para llevar a cabo el estudio teórico de la absorción de una molécula heterogéneamente cargada por un microgel en presencia de electrolito 1:1. De esta forma, mediante un procedimiento relativamente sencillo, hemos estudiado el potencial de fuerza media entre el microgel y la molécula para diferentes valores de dipolo eléctrico y carga neta de la molécula. También hemos considerado los efectos dependientes de la concentración salina, la exclusión de volumen y las interacciones hidrófobas. Hemos identificado cinco estados diferentes de absorción en este sistema, desde la completa repulsión de la biomolécula hasta su absorción en el interior del microgel, pasando por estados de adsorción superficial estables y metaestables. 2.3. Propiedades interfaciales de microgeles termosensibles Anteriormente hemos comentado que existe un creciente interés por el estudio de monocapas y otras estructuras de microgeles. Por ese motivo, en el artículo VI [58] de esta tesis hemos abierto una nueva línea de investigación en nuestro trabajo para estudiar las características interfaciales de microgeles termosensibles con el objetivo de explorar sus potenciales aplicaciones como estabilizadores de emulsiones sensibles a estímulos externos. De esta forma, hemos investigado el comportamiento de microgeles de PVCL en la interfase aire-agua, tanto experimental como teóricamente. El trabajo experimental se ha llevado a cabo mediante diferentes técnicas, tales como estudio de la adsorción, reología dilatacional y monocapas de Langmuir. Por otra parte, los resultados experimentales se han interpretado cualitativamente en términos de los potenciales efectivos entre pares de microgeles. 3. Conclusiones De los trabajos realizados en la primera parte de esta tesis doctoral, en la que se estudia la permeación de iones en el interior de microgeles, se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1) Cuando los iones difunden a través de los poros del microgel no sólo sufren el efecto de la interacción electrostática, sino que los efectos de exclusión de volumen determinan el grado de penetración y la distribución de iones en el interior y exterior de la partícula. Este efecto estérico es el responsable del significativo aumento de la carga efectiva del microgel que se observa experimentalmente cuando el microgel se compacta. También se ha demostrado que es necesario incluir la interacción estérica microgel-ion en los modelos teóricos para reproducir con exactitud los perfiles de densidad iónica obtenidos en las simulaciones Monte Carlo. 2) El formalismo integral de Ornstein-Zernike, junto a la ecuación de cierre HNC, en un método fiable para predecir las funciones de distribución radial de iones en el interior y en torno a los microgeles, incluso en casos de partículas con elevada carga eléctrica, iones multivalentes y condiciones de fuerte confinamiento. En este marco teórico, la división de la interacción efectiva microgel-ion en dos términos aditivos, uno electrostático y otro estérico, proporciona resultados satisfactorios. Para calcular el término estérico es necesario modelar la estructura interna del microgel. Se ha observado que la red de polímeros resulta sorprendentemente bien representada mediante un modelo de monómeros esféricos superponibles aleatoriamente distribuidos, a pesar de que supone una considerable aproximación de la estrucutra real del microgel. 3) La valencia de los contraiones que penetran en el interior de los microgeles juega un papel relevante en varios aspectos. En primer lugar, los contraiones multivalentes neutralizan la carga del microgel de manera mucho más eficiente que los monovalentes, lo que produce valores mucho más bajos de la carga efectiva. Como consecuencia de ello, la transición de fase volumétrica de los microgeles se produce a temperaturas más bajas. Este efecto es más acusado cuanto más carga posean los microgeles. Asimismo, cuanto mayor es la valencia más significativo es el efecto de condensación iónica en el interior de la red de polímeros, lo que se traduce en un fuerte descenso de la movilidad electroforética de los microgeles. 4) En el interior de la red polimérica los perfiles de densidad iónica son homogéneos y se satisface la electroneutralidad. No obstante, en las inmediaciones de la interfase microgel-agua se viola dicha electroneutralidad. Podemos deducir por tanto que la carga efectiva del microgel procede fundamentalmente de la superficie de la red de polímeros. 5) Las simulaciones mediante Dinámica Molecular de un oligómero y una membrana de PNIPAM en agua confirman que los campos de fuerza AMBER y OPLS-AA en combinación con el modelo de agua SPC/E reproducen satisfactoriamente el colapso de las cadenas observado experimentalmente. El hecho de que la temperatura de colapso no varíe entre el oligómero y la membrana hace pensar que las interacciones polímero-polímero no juegan un papel relevante en la transición de volumen. Asimismo, en el caso de una membrana en presencia de electrolito se ha observado el efecto de precipitación salina, más acusado en el caso de NaCl que en el caso de NaI, como se observa también experimentalmente. De la segunda parte de esta tesis, centrada en el estudio teórico de las interacciones que intervienen en la absorción de biomoléculas por parte de los microgeles, podemos concluir lo siguiente: 6) El potencial de fuerza media total entre el microgel y la biomolécula es el resultado de una compleja interacción en la que intervienen diferentes fenómenos físico-químicos. Entre ellos, la interacción electrostática juega un papel fundamental en la absorción y la distribución de la molécula en el interior del microgel. Asimismo, la distribución de carga heterogénea en la molécula que produce un dipolo eléctrico es un factor determinante a tener en cuenta, especialmente cuando se persigue la adsorción superficial de la partícula en la corteza del microgel. Este trabajo demuestra que, a pesar del gran número de parámetros que intervienen en la absorción de biomoléculas en microgeles, es posible predecir cualitativamente el comportamiento de estos sistemas mediante un formalismo teórico relativamente sencillo. Por último, del análisis del comportamiento interfacial de microgeles termosensibles en la interfase aire-agua se han obtenido dos resultados principales: 7) A temperaturas por encima de la temperatura de transición de volumen (VPTT) un mayor número de microgeles compactados alcanzan la interfase. Bajo estas condiciones la superficie acomoda más partículas y la densidad de empaquetamiento aumenta a medida que los microgeles se compactan, lo que resulta en una configuración más estable y resistente a la agregación que a temperaturas más bajas que la VPTT. 8) El análisis de las monocapas de Langmuir proporciona información muy útil sobre la estuctura interna de los microgeles. Efectivamente, mediante el estudio de los cambios en las interacciones microgel-microgel con la disminución de la distancia entre partículas, y la comparación con medidas experimentales del diámetro hidrodinámico, es posible estimar el tamaño de la corteza y el núcleo de los microgeles.