Diseño y síntesis de ligandos de g- quadruplexes que incorporan carbohidratos como potenciales fármacos anticancerígenos

Resumen

La presente tesis doctoral se centra en el desarrollo de nuevos ligandos de ADN en G-cuádruplex y su potencial uso como agentes anticancerígenos. Los ADN en G-cuádruplex son estructuras secundarias que se forman en secuencias del ADN y ARN ricas en guaninas, vinculadas a la regulación de importantes procesos biológicos como la replicación y la transcripción de determinados genes.1–4 Se han sintetizado y evaluado dos familias de compuestos como ligandos de estas nuevas dianas terapéuticas: fenil ditriazoles5 y naftaleno diimidas.6–8 El punto común en ambas familias es la incorporación de carbohidratos en la estructura con el fin de conferir selectividad en su unión a los ADN en G-cuádruplex, así como mejorar su entrada en células tumorales. La familia de fenil ditriazoles (PTDZ) fue sintetizada por conjugación de azidoazúcares con el 1,3-dietinil benceno mediante la cicloadición 1,4- de Huisgen (click chemistry).9 Así se sintetizaron compuestos simétricos, con azúcares neutros como cadenas laterales; y compuestos asimétricos, con un azúcar neutro y una cadena cargada positivamente. Se midió la capacidad de dichos compuestos para estabilizar los ADN en cuádruplex mediante estudios de fusión por FRET. Los derivados simétricos no mostraron capacidad alguna de estabilización mientras que los asimétricos incrementaban la Tm del ADN en cuádruplex del telómero humano. Además, no mostraron estabilización de dúplex de ADN, siendo bastante selectivos por el ADN en cuádruplex. Los resultados fueron muy similares para todos los compuestos asimétricos por lo que la cadena cargada debe jugar un papel importante. Los experimentos adicionales de CD, SPR y masas confirmaron la selectividad de esta familia por cuadruplexes, aunque la afinidad no resultó ser tan potente como en otros ligandos de cuádruplex previamente publicados. Mediante estudios de RMN se pudo localizar el área del cuádruplex del telómero humano que más se ve afectada por la interacción con unos de los ligandos asimétricos. La actividad anticancerígena observada en esta familia fue muy limitada cuando se evaluó su citotoxicidad sobre varias líneas cancerígenas humanas (MCF7, HT-29, LN-229 o HeLa). La familia de napftaleno diimidas (NDI) se sintetizó en colaboración con el Prof. Mauro Freccero (Universidad de Pavía) siguiendo la misma estrategia sintética que con la familia anterior. Se incluyó además un NDI control sin azúcar. Los resultados de la síntesis, los estudios biofísicos y biológicos han sido publicados recientemente en Chem. Eur. J. 2017, 23(9), 2157-2164. La unión de los derivados carbohidrato-NDI a los ADN en cuádruplex resultó ser mucho más fuerte que la de los derivados PTDZ y similar a la de otros NDI descritos con anterioridad. El ensayo de competitividad demostró que son bastante selectivos a las estructuras de ADN en cuádruplex. La citotoxicidad observada fue también muy superior a la de la familia anterior, con valores de IC50 en el rango nanomolar o bajo micromolar. Se observaron diferencias según el carbohidrato presente en la estructura. El derivado con glucosa unida directamente a la NDI presentó la menor toxicidad, mientras que el compuesto sin azúcar 67 y los que presentan una cadena de dos carbonos entre el azúcar (glucosa o manosa, 65 y 66) y el núcleo aromático presentaron la mayor toxicidad. Se hicieron estudios de entrada celular mediante citometría de flujo y espectroscopia de fluorescencia. Se observaron diferencias importantes entre el compuesto control sin carbohidrato 67 y los conjugados de carbohidrato-NDI. El compuesto control penetra en la célula de manera casi instantánea y sin depender de la temperatura, mientras que los conjugados carb-NDIs dependían de la temperatura, tiempo de incubación y de la disponibilidad del carbohidrato. Estos resultados pudieron relacionarse con los diferentes datos de citotoxicidad obtenidos: aquellos que entran en mayor proporción y con más rapidez resultaron ser los más citotóxicos. Además, cuando las células fueron previamente incubadas con inhibidores de GLUT (transportadores de glucosa), los resultados de entrada celular parecen indicar que los derivados con espaciador 65 y 66 son transportados, al menos parcialmente, por GLUT4. La fluorescencia inherente de los carb-NDI permitió localizarlos dentro de la célula mediante microscopía confocal, principalmente en el núcleo. Se realizaron ensayos de actividad antiviral frente a VIH con ambas familias en el laboratorio de la Prof. Sara Richter (Universidad de Padua), pero ninguno de los compuestos mostró toxicidad relevante. Como conclusión se puede incluir el desarrollo de dos familias de compuestos en los que se ha incorporado carbohidratos en su estructura: fenil ditriazoles y NDIs. Los primeros no mostraron una afinidad elevada hacia a los G4, pero sí una gran selectividad. Sin embargo, su actividad antiproliferativa fue muy moderada. La familia de conjugados carbohidratos-NDIs presentaron una alta capacidad de estabilización de las estructuras formadoras de cuádruplex y además mostraron una gran actividad antiproliferativa frente a las líneas tumorales MCF-7, HT-29 y HeLa. Se vieron diferencias en los valores de IC50 según los diferentes motivos de carbohidrato y su accesibilidad en la estructura, que pusieron además relacionarse parcialmente con las diferencias observadas en su entrada celular. 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