Metodología Elisa para estudiar la estabilidad de medicamentos biotecnológicos

Resumen

METODOLOGÍA ELISA PARA ESTUDIAR LA ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS En la actualidad, y desde su aparición, el empleo de medicamentos biotecnológicos (MB) ha experimentado un crecimiento continuo [1-6], convirtiéndose en los tratamientos de elección y siendo utilizados en primera y segunda línea de tratamiento en muchos pacientes para diversos tipos de cáncer así como para el tratamiento de diferentes patologías de tipo inmune [6]. Estos fármacos han permitido reducir la mortalidad y la morbilidad y han mejorado la calidad de vida de millones de pacientes con enfermedades crónicas, además de contribuir al desarrollo de nuevos métodos diagnósticos, siendo así considerados como la punta de lanza en la innovación de la terapéutica farmacológica. Sin embargo, y dado su origen biológico, el coste que conlleva el tratamiento con este tipo de medicamentos es muy elevado, llegando a superar en algunos casos los 40.000 € por año de tratamiento [7-10], hecho que implica que en países en vías de desarrollo el acceso a este tipo de terapias se vea restringido [11-14]. Además, y también como consecuencia de su origen, la estabilidad que presentan este tipo de medicamentos en condiciones habituales de uso hospitalarias es muy limitada, siendo para la mayoría de 24 a 48 horas una vez abiertos los viales y reconstituidos en los casos que así lo requieren y según las indicaciones del fabricante. Esta limitada estabilidad es por tanto motivo de la generación diaria de excedentes de estos medicamentos, lo cual supone un importante aumento del gasto sanitario [14-20]. De ahí la importancia de realizar estudios de estabilidad en condiciones de uso hopitalarias de los diferentes MB susceptibles de alteraciones (en los que se enmarca esta Tesis), cuyo objetivo principal sea el establecimiento del tiempo real que el MB es capaz de conservar su actividad biológica, pudiendo ser este, en algunos casos, superior al indicado por el fabricante, lo cual supondría un menor gasto sanitario, puesto que la generación de remanentes sería reducida y cada vial de MB podría ser mejor aprovechado. De los diferentes aspectos que deben de ser evaluados en la estabilidad de un MB cuyo principio activo es un anticuerpo monoclonal, esta Tesis Doctoral se ha centrado en la funcionalidad de los mismos medida a partir de su reacción antígeno-anticuerpo, denominada como actividad biológica. Para ello, se han desarrollado diferentes ELISAs específicos para el estudio de cuatro de los anticuerpos monoclonales (mAbs) empleados con mayor frecuencia en la actualidad, concretamente para los mAbs infliximab, bevacizumab, cetuximab y trastuzumab. Dichos ELISAs se basan en la reacción de cada mAb con su Ag correspondiente, siendo este último además su diana terapéutica. La finalidad de estos inmunoensayos es disponer de una herramienta válida y robusta que permita determinar la estabilidad, desde un punto de vista de la funcionabilidad biológica, de estos fármacos biotecnológicos (FBIOs) en sus propias medicinas, Remicade®, Avastin®, Erbitux® y Herceptin®, respectivamente, en condiciones de uso hospitalarias y tras la apertura del vial. Así, para el estudio y determinación de infliximab ha sido desarrollado un ELISA directo y un ELISA indirecto y para bevacizumab, cetuximab y trastuzumab han sido puestos a punto ELISAs indirectos. Estos ELISAs han sido validados siguiendo las recomendaciones de organismos internacionales (ICHs) y de estudios de validación específicos de inmunoensayos [21-28], siendo en todos los casos los datos resultantes satisfactorios para todos los parámetros estudiados: modelo de calibración, intervalo de concentraciones de aplicación del método, límites de detección y cuantificación, precisión, exactitud/veracidad y especificidad/selectividad y tratándose por tanto de métodos de análisis apropiados para la determinación cuantitativa, de forma sencilla y rápida, de la actividad biológica de estos mAbs. La especificidad/selectividad de los métodos se ha evaluado llevando a cabo estudios de reacciones cruzadas entre los mAbs estudiados, para estimar las posibles interferencias producidas por mAbs similares y quedando establecida de este modo la aplicabilidad del método para el análisis de mAbs no específicos. Los resultados obtenidos muestran que los ELISAs desarrollados son específicos para cada FBIO para el que han sido desarrollados y validados, excepto para cetuximab, en el que existe una cierta afinidad entre el EGFR y los otros mAbs comerciales ensayados (de un 20 % aproximadamente). También se han realizado estudios de degradación acelerada (estudios de estrés) de los medicamentos estudiados, que aunque se han revelado como no adecuados en el contexto de la validación de los métodos ELISA (como discutido en esta Tesis Doctoral), sí son muy importantes desde el punto de vista del conocimiento de las pautas de degradación de los mismos, lo cual es fundamental para una correcta aplicación de los mismos. En estos estudios, los MB evaluados han sido expuestos a diferentes condiciones de degradación durante 24 horas, tras las cuales han sido analizados mediante la aplicación de los inmunoensayos desarrollados para cada uno de ellos. A partir de los resultados obtenidos, se puede afirmar que todos los MB presentan cierta actividad remanente tras su exposición ante pH extremos, medios oxidativos, fuerza iónica, luz visible y temperatura de 50°C, siendo la temperatura de 70°C la única condición ambiental que da lugar a la degradación total, en cuanto a actividad biológica se refiere, de los MB evaluados, lo cual se justifica por una total desnaturalización de los mAbs a esa temperatura. Con respecto a la fuerza iónica del medio, empleando NaCl como electrolito, los resultados manifiestan una gran estabilidad frente a este factor, lo cual es positivo dado que es el medio en el que se disponen las correspondientes preparaciones farmacéuticas. También debe de prestarse atención a la exposición de estos medicamentos a la luz solar, ya que promueve también disminución importante de la funcionabilidad biológica. Los diferentes ELISAs desarrollados han sido aplicados en estudios de estabilidad en el tiempo empleando diferentes unidades de los MB Remicade®, Avastin®, Erbitux® y Herceptin® [29-39]. Los estudios de estabilidad se han realizado haciendo controles periódicos de la actividad biológica mantenida por los MB tras su conservación a 4°C y a -20°C, habiendo sido evaluada una unidad del medicamento que contiene el TTZ también a -80°C. A partir de los resultados obtenidos en estos estudios de estabilidad, se puede concluir que de entre los diferentes MB estudiados, Avastin® es el que presenta mayor estabilidad desde el punto de vista de su actividad biológica después de la fecha de uso indicada por el fabricante, siendo los demás MB estables durante no más de 24-48 horas, periodo que coincide con el indicado por el fabricante. Para corroborar los resultados de estabilidad obtenidos, como líneas de actuación futuras, se propone realizar estudios empleando más unidades de cada MB, así como estudios paralelos de funcionalidad empleando líneas celulares. BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA [1] Asociación Española de Bioempresas (ASEBIO) Informe Anual ASEBIO 2014. El 9% del PIB español depende ya de la biotecnología.16.07.2015. http://www.quimica.es/noticias/153688/ © CHEMIE.DE Information Service GmbH. [2] Farmaindustria. Presidenta de Farmaindustria. XIV Encuentro de la industria farmacéutica española UIMP “Los nuevos medicamentos biológicos: revolución terapéutica y económica” Santander, 4 y 5 de septiembre 2014. [3] DiMasi. Paquette, Pharmacoeconomics 2004; 22 (Suppl 2):1-14. [4] Genoma Humano España. Informe 2011 sobre relevancia biotecnología en España. [5] Franco Fraguas M.L. and Savio Quevedo E. Medicamentos biotecnológicos. Conceptos básicos y relevancia en el contexto clínico. Tendencias en Medicina. Octubre 2008. 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