Study of the mechanisms of iron homeostasis in the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis

Resumen

Las simbiosis micorrícico arbusculares (MA) que implican a la mayoría de las plantas y los hongos Glomeromycota (MA) son partes integrales y funcionales de las raíces de las plantas. En estas asociaciones, el hongo no sólo coloniza la corteza de la raíz, sino que también mantiene una red extensa de hifas que se extienden fuera de la raíz en el entorno circundante. Estas hifas externas contribuyen a la absorción vegetal de nutrientes de baja movilidad, como P, Fe y Zn. Además de mejorar la nutrición mineral de la planta, los hongos MA alivian de la toxicidad de metales pesados a las plantas hospedadoras. El metal pesado Fe desempeña un papel esencial en muchos procesos biológicos, pero es tóxico cuando está presente en exceso, ya que puede producir radicales libres a través de la reacción de Fenton. Por ello, es de particular importancia el control de su transporte y homeostasis en todos los organismos vivientes. Los hongos MA tienen un papel importante en la modulación de la adquisición de metales pesados por la planta en un amplio rango de concentración del metal en el suelo y se han considerado un elemento clave en la mejora de las concentraciones de micronutrientes de los cultivos y en la fitorremediación de suelos contaminados. Aunque el principal beneficio de la asociación MA es una mejora en el estado del P de la planta micorrizada, los hongos MA también desempeñan una función en la nutrición de Fe de la planta hospedadora, y se han encontrado evidencias directas de la capacidad del micelio extrarradical (ERM, en inglés extraradical mycelium) para absorber Fe del suelo y transferirlo a la planta hospedadora. Por el contrario, otros estudios han demostrado que los hongos MA desempeñan un papel reduciendo la absorción de Fe cuando la concentración en el suelo es alta. Sin embargo, se sabe poco acerca de los mecanismos de absorción y homeostasis de Fe en micorrizas arbusculares. En esta tesis doctoral se han utilizado varios métodos para analizar los mecanismos de homeostasis de Fe en el hongo MA modelo Rhizophagus irregularis, fácilmente cultivable en cultivos monoxénicos y cuyo genoma se ha secuenciado recientemente. Se han realizado análisis a genoma completo con el objeto de identificar genes de R. irregularis implicados en el transporte y homeostasis de Fe, haciendo uso de bases de datos de transporte, sitios web de genomas de organismos y herramientas bioinformáticas in silico para análisis de secuencias, como software para predicciones de estructura proteica y métodos para análisis filogenéticos. Para los estudios experimentales, se establecieron cultivos monoxénicos de R. irregularis con fin de obtener material exclusivamente fúngico para el subsecuente aislamiento génico, análisis de expresión génica o ensayos enzimáticos. Dado que no es posible manipular genéticamente los hongos MA, los análisis funcionales y de localización de los genes recién identificados de R. irregularis se llevaron a cabo en un sistema heterólogo: la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Como un primer enfoque para entender los mecanismos de homeostasis de Fe, se realizó un análisis a genoma completo de transportadores de Fe. Este análisis in silico permitió la identificación de 12 marcos abiertos de lectura en el genoma de R. irregularis, que codifican potencialmente transportadores de Fe implicados en la adquisición de hierro desde el suelo o en su uso y almacenamiento en diferentes compartimentos celulares. La comparación filogenética con los genomas de un grupo de hongos de referencia mostró una expansión de algunas familias de transportadores de Fe. El análisis de los perfiles transcriptómicos publicados de R. irregularis reveló que algunos genes se regularon al alza en raíces micorrizadas comparados con esporas germinadas y ERM, lo que sugirió que el Fe es un metal importante para la colonización de la planta. Dentro del complemento completo de genes que codifican transportadores de Fe identificados en el genoma de R. irregularis se encontraron dos componentes de una vía reductiva de transporte de Fe de alta afinidad, RiFTR1 y RiFTR2, que mostraron una alta homología con la permeasa de Fe Ftr1 de S. cerevisiae. En el sistema bien caracterizado de S. cerevisiae, el primer paso del sistema reductivo de asimilación de Fe se realiza por las metalorreductasas Fre1 y Fre2. A continuación, el Fe reducido es absorbido rápidamente por un complejo de transporte de alta afinidad específico de hierro ferroso que consiste en una ferroxidasa multicobre de membrana plasmática (Fet3) que oxida el Fe, el cual es entonces transportado al citosol por una permeasa (Ftr1). Cuando se examinó in vivo la actividad reductasa férrica sobre el micelio de R. irregularis, se encontró un nivel basal de actividad en el micelio crecido en placas control, que fue activada cuando el micelio se cultivó en medio sin Fe. Estos datos indicaron que el sistema reductivo de absorción de Fe está funcionando en R. irregularis. Sólo se encontró un homólogo de reductasa férrica, RiFRE1, en el genoma de R. irregularis, pero no fue capaz de restaurar el pobre crecimiento del mutante de levadura fre1-2 en condiciones de deficiencia de Fe, probablemente debido a la baja homología de secuencia de RiFRE1 y ScFRE1-2. La caracterización proteica y los análisis de expresión génica de los otros dos componentes putativos de la vía reductiva de adquisición de Fe en R. irregularis, RiFTR1 y RiFTR2, indicaron que RiFTR1 juega un papel in vivo en la adquisición reductiva de Fe de alta afinidad en ambientes limitantes de Fe. Sin embargo, el papel de RiFTR2 en R. irregularis no se ha podido dilucidar en nuestro estudio, probablemente debido a que la proteína no pudo salir del retículo endoplasmático, como se mostró en los ensayos de localización en levadura. También se encontró que los genes que codifican los tres componentes de la vía reductiva de asimilación de Fe identificados (RiFRE1, RiFTR1 y RiFTR2) son genes de respuesta a Fe, como se mostró con los análisis de expresión génica realizados por RT-PCR a tiempo real. Con el fin de identificar el compañero ferroxidasa de RiFTR1, se realizó una búsqueda de genes candidatos pertenecientes a la familia de oxidasas multicobre (MCOs, del inglés multicopper oxidases). Con este estudio se concluyó que R. irregularis tiene al menos nueve MCOs (RiMCO1-9) en el genoma. Los análisis de intrones y de similitud definieron cinco subfamilias génicas. Sin embargo, un análisis filogenético de secuencias MCO de diferentes grupos taxonómicos reveló que todas las RiMCOs pertenecen al grupo de ferroxidasas/lacasas, y ninguna se agrupó con las ferroxidasas tipo Fet3. RiMCO1 fue el único gen de MCO que mostró un patrón de expresión génica típico de un componente del transporte de Fe de alta afinidad. Además, RiMCO1 permite que el mutante fet3 de levadura absorba Fe. Estos datos sugieren que RiMCO1 podría tener un papel en el sistema reductivo de absorción de Fe de alta afinidad junto con el transportador de Fe RiFTR1 en el ERM. Sin embargo, algún(os) otro(s) miembro(s) de la familia RiMCO también podría(n) tener actividad ferroxidasa. Los análisis de expresión génica también revelaron que algunos transcritos fueron muy abundantes en el ERM (RiMCO1 y RiMCO5) y otros en el micelio intrarradical (RiMCO2), lo que sugiere que las diferentes RiMCOs tienen funciones específicas. Finalmente, para intentar identificar algunos otros elementos implicados en la regulación de la homeostasis de Fe en R. irregularis, y dado que se ha demostrado que las glutarredoxinas (GRXs) Grx3-4 y Grx5 de levadura tienen un papel en la homeostasis de Fe, se identificó y caracterizó el complemento completo de GRXs en R. irregularis (RiGRX1,4,5,6) (RiGRX1 se caracterizó previamente en nuestro grupo). Los análisis funcionales en el sistema heterólogo mostraron que mientras que las cuatro GRXs de R. irregularis están implicadas en la protección frente a estrés oxidativo, RiGRX4 y RiGRX5 (homólogas a ScGrx3-4 y ScGrx5, respectivamente) también tienen un papel en la homeostasis de Fe en levadura. Además, los datos de expresión génica mostraron que RiGRX4 fue el único gen de glutarredoxina de respuesta a Fe, lo que sugirió que podría estar implicado en la regulación de la absorción de Fe mediante la interacción con factores de transcripción de respuesta a hierro, como se ha demostrado anteriormente para sus homólogos en otros hongos. El aumento de la expresión de RiGRX1 y RiGRX6 en el micelio intrarradical sugiere que estas GRXs podrían tener un papel clave en la protección frente a estrés oxidativo de R. irregularis durante su fase in planta. A pesar de que en esta tesis doctoral sólo se han caracterizado los transportadores del hongo implicados en la absorción de hierro del suelo y las glutarredoxinas, se propone un modelo integrador para la regulación de la homeostasis de hierro y su transporte a través de la vía micorrícica en una raíz micorrizada.