2-tridecanona como molécula señal en sinorhizobium melilotiimpacto en la nodulación de alfalfa e identificación de las bases moleculares implicadas

Resumen

Los rizobios son un grupo amplio de bacterias del suelo capaces de establecer simbiosis mutualistas fijadoras de nitrógeno con plantas leguminosas. Esta relación simbiótica despierta gran interés, no sólo por su importancia agronómica y ecológica, sino porque constituye un excelente modelo para el estudio de las interacciones planta-bacteria. Existe una gran información sobre los genes y mecanismos que regulan los aspectos más relevantes de la simbiosis Rhizobium-leguminosa como son los procesos de nodulación y fijación de nitrógeno. Sin embargo, el conocimiento acerca de las etapas más tempranas de la interacción, que comprenden la adsorción bacteriana y la colonización de la superficie de la raíz, es todavía escaso. Fenotipos bacterianos asociados a la vida en superficie como el swarming y la formación de biopelículas, se han relacionado con la capacidad de diversas bacterias de colonizar e invadir a sus hospedadores eucariotas. El swarming es un tipo de translocación bacteriana en superficie, dependiente de flagelos, que permite el movimiento rápido y coordinado de toda una población sobre una superficie semisólida, y que conlleva un proceso de diferenciación. Las biopelículas por su parte son comunidades sésiles de microorganismos embebidos en una matriz de polisacáridos y unidos entre sí y a la superficie. Estos fenómenos opuestos han sido muy estudiados en bacterias patógenas, en las que se ha visto que ambos operan de forma coordinada, compartiendo en muchos casos elementos regulatorios comunes, y aportan una serie de ventajas a las poblaciones bacterianas que los llevan a cabo como son, mayor resistencia frente agentes antimicrobianos y mayor capacidad de invasión y virulencia (Kearns 2010; Verstraeten et al. 2008). Los pocos estudios que hay en bacterias beneficiosas como Rhizobium, indican que determinantes bacterianos implicados en swarming y/o formación de biopelículas, o que se expresan durante estos procesos, son importantes para la interacción con su planta hospedadora. Sinorhizobium meliloti, el simbionte de alfalfa y modelo de estudio en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, es capaz de desplazarse sobre la superficie de medios semisólidos y formar biopelículas tanto en sustratos abióticos como bióticos (Bernabéu-Roda et al. 2015; Amaya-Gómez et al. 2015; Nogales et al. 2012 Soto et al. 2002). Sin embargo, los determinantes bacterianos, así como las señales químicas que controlan dichos fenotipos son aún desconocidos. Las investigaciones realizadas en el grupo de la Dra. Soto han permitido identificar mecanismos de control que regulan de manera inversa swarming y formación de biofilm en esta bacteria (Amaya-Gómez et al. 2015). Uno de ellos implica la participación de FadD, una acil-CoA ligasa implicada en la activación de ácidos grasos de cadena larga para su degradación mediante β-oxidación. La inactivación del gen fadD en S. meliloti promueve el desplazamiento en superficie, dificulta la formación de biopelículas e interfiere negativamente con la colonización y nodulación de raíces de alfalfa (Soto et al. 2002). La caracterización bioquímica de un mutante fadD de la cepa GR4 de S. meliloti reveló la acumulación de compuestos lipídicos, tales como ácidos grasos libres, el aldehído dodecanal y la metilcetona (MK) 2-Tridecanona, que se encontraron presentes en sobrenadante de cultivos del mutante pero no de la cepa parental. La evaluación de los distintos compuestos permitió comprobar que sólo la MK 2-Tridecanona (2-TDC) estimulaba dicho movimiento cuando era aplicada en el medio; estimulación que era dependiente de dosis. Posteriormente se vio que la 2-TDC en su forma volátil también inducía desplazamiento en superficie dependiente de dosis. Además dicho efecto es específico de la movilidad en superficie y afecta también a mutantes aflagelados de S. meliloti, lo que indica que la 2-TDC estimula movilidad en superficie mediada por mecanismos tanto dependientes como independientes de acción flagelar. La 2-TDC es una metilcetona volátil conocida como insecticida natural. Producida en cantidades importantes por especies silvestres de tomate (Solanum habrochaites subsp. glabratum), se la ha relacionado con la alta resistencia innata de estas plantas frente al ataque de insectos herbívoros (Williams et al. 1980). Aunque en la literatura está descrita la producción de 2-TDC por diversas plantas (Kirillov et al. 2017; Ghribi et al. 2016; Antonious, 2013), animales (Wood et al. 1995; Soini et al. 2007) y numerosos aislados bacterianos (Lemfack et al. 2014), nunca antes se había descrito sus efectos sobre bacterias. Estudiar a nivel molecular cómo la 2-TDC es capaz de controlar la movilidad en superficie de una bacteria modelo que interacciona con plantas, así como investigar posibles efectos adicionales, podría desvelar nuevos componentes y mecanismos reguladores empleados por las bacterias durante la interacción con sus plantas hospedadoras. Este conocimiento podría ser utilizado para controlar la infección por bacterias patógenas, o para el diseño de microorganismos beneficiosos más efectivos. Por todo ello, el Objetivo General de esta Tesis Doctoral ha sido identificar nuevos mecanismos moleculares que participan en las etapas iniciales del establecimiento de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, a través de un estudio en profundidad de los efectos producidos por la 2-TDC en la biología de la bacteria modelo S. meliloti, tanto en vida libre como en simbiosis, y la identificación de algunas de las bases moleculares responsables del modo de acción de este compuesto. Como parte del primer objetivo específico de la Tesis se ha evaluado cómo afecta la 2-TDC a la formación de biopelículas y la capacidad simbiótica de S. meliloti, confirmándose que la acumulación de la MK es responsable de algunos de los fenotipos generados por la mutación fadD. La 2-TDC redujo la capacidad de formar comunidades adheridas a superficie en las cepas silvestres GR4 y Rm1021 de S. meliloti. Curiosamente, hemos podido comprobar que esta molécula también afecta a la movilidad y la formación de biopelículas en bacterias filogenéticamente alejadas de S. meliloti, incluyendo patógenos vegetales y animales. Aunque el efecto de la MK en la movilidad es variable, pudiendo estimularlo (en bacterias fitopatógenas del complejo Pseudomonas) o inhibirlo (patógenos de animales como Pseudomonas aeruginosa y Salmonella enterica) según la especie bacteriana, en todos los casos estudiados, la presencia de 2-TDC disminuye la formación de biofilm sin llegar a afectar el crecimiento bacteriano. Estos resultados indican que la 2-TDC es una nueva molécula de señalización en bacterias que actuando como volátil, podría participar no sólo en comunicación intra- e inter-específica sino incluso en comunicación con organismos superiores, con importantes consecuencias para la ecología de estos microorganismos. Cuando se analizó el efecto de la 2-TDC en el establecimiento de la simbiosis con plantas de alfalfa, se comprobó que la aplicación de la MK en etapas tempranas de la interacción provoca un retraso en la aparición de los primeros nódulos, así como una reducción significativa en el número medio de nódulos desarrollados por la planta a lo largo del tiempo, efecto que es dependiente de dosis. Por otro lado, hemos constatado el efecto protector que ejerce la 2-TDC en plantas de tomate frente al desarrollo de la mancha o peca bacteriana, enfermedad causada por la bacteria P. syringae pv tomato. La aplicación de la MK, con un efecto que también es dependiente de dosis, retrasa y reduce la aparición de los síntomas típicos de la enfermedad. En ambas interacciones planta-bacteria, el efecto causado por la 2-TDC se ha relacionado con una menor capacidad de la bacteria de colonizar los tejidos vegetales (colonización de la superficie de la raíz en el caso de S. meliloti, o crecimiento bacteriano en el apoplasto foliar en el caso de Pto). Este efecto, que se correlaciona con la menor capacidad de formar biopelículas en superficies abióticas en presencia de la MK, podría ser la causa del efecto negativo de la 2-TDC en establecimiento de la asociación planta-bacteria. No obstante, la posibilidad de que la 2-TDC esté siendo reconocida por la planta y desencadene respuestas que interfieran con el proceso colonizador e infectivo de la bacteria no es descartable. A favor de esta hipótesis está la observación realizada en esta Tesis de que plantas de alfalfa tratadas con 2-TDC previamente a la inoculación, siguen experimentando retraso en la cinética de nodulación, aun cuando el rizobio no está en contacto en ningún momento con la MK. Gracias a la adopción de una metodología específica para la detección de volátiles, microextracción en fase sólida (SPME) (Semenov et al, 2002) y posterior análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS), se ha podido demostrar por primera vez que una cepa silvestre de S. meliloti es capaz de producir 2-TDC volátil tras crecimiento en medio mínimo semisólido. Además hemos comprobado que la actividad FadD contribuye a regular los niveles de producción de esta MK. A pesar de la incesante aparición de estudios que muestran que compuestos volátiles producidos por bacterias tienen una función señalizadora (Audrain et al, 2015; Kim et al. 2013), los mecanismos de percepción y respuesta frente a dicha señal son aún desconocidos. Nuestros análisis han mostrado que existe una dependencia entre la estructura y la actividad biológica de la 2-TDC. Así, tanto la posición del grupo carbonilo como la longitud de cadena determinan la capacidad de esta molécula para estimular el desplazamiento en superficie. Esto sugiere la existencia de un posible mecanismo de reconocimiento específico mediado por un receptor. Por otra parte, aunque el efecto promotor de la movilidad dependiente de flagelos tiene su explicación en una mayor expresión de genes flagelares inducida por la 2-TDC, aún se desconoce cuál es el origen del efecto ejercido en la movilidad independiente de flagelos. Nuestros resultados descartan que la 2-TDC actúe como surfactante o induzca cambios a nivel de la estructura y las propiedades fisicoquímicas de la envuelta celular. La movilidad en superficie y la formación de biopelículas son fenotipos que en diversas bacterias se encuentran regulados por quorum sensing (Papenfort & Bassler 2016). Las investigaciones realizadas en este trabajo de Tesis Doctoral, indican que la 2-TDC no afecta la expresión de genes de quorum sensing en S. meliloti. Sin embargo, sí hemos podido observar una mayor acumulación de las moléculas señal acil-homoserina lactonas (AHL) en presencia de 2-TDC, que podrían ser responsables, al menos en parte, de los efectos causados por la MK. El hecho de que este fenómeno también tenga lugar en un mutante sinI de S. meliloti, incapaz de sintetizar AHL, sugiere que de algún modo la 2-TDC interfiere negativamente con el turnover o degradación de la molécula señal. Para obtener información adicional sobre el mecanismo de acción a través del cual la 2-TDC ejerce sus efectos en nuestra bacteria de estudio, se han seguido dos aproximaciones distintas que constituyen objetivos específicos de la Tesis Doctoral. En una de ellas, recogida en el Capítulo 2, se procedió al aislamiento y caracterización de transposantes derivados de la cepa GR4 de S. meliloti que fuesen insensibles a 2-TDC; esto es, no incrementasen su capacidad de translocación en superficie en respuesta a la MK, o lo hiciesen en un menor grado en comparación a la cepa parental. Los resultados derivados de la caracterización genética y fenotípica de un total de 19 transposantes han permitido obtener datos interesantes acerca del modo de acción de la 2-TDC. En primer lugar todos los mutantes afectados en la respuesta en movilidad frente a 2-TDC lo estaban también en su capacidad para desplazarse en superficie. Esto sugiere que gran parte de los componentes implicados en el mecanismo de acción de la MK participan en el control de la movilidad bacteriana en superficie. Por otro lado, los genes afectados por el transposón fueron muy diversos desde el punto de vista funcional, habiéndose identificado genes que codifican componentes del flagelo (flhA y flgG), transportadores (smc01368 y smc02160), un sistema regulador de dos componentes (ntrYX), proteínas implicadas en metabolismo lipídico (sma1398), proteínas que participan en metabolismo de los segundos mensajero di-GMPc (smc03141 y sma01379) y ppGpp (relA) y genes con función desconocida (smc00190 y smc02081). De entre los 11 genes identificados, sólo los transposantes afectados en smc03141 y en ntrY resultaron ser completamente insensibles a 2-TDC, apuntando así a su papel relevante en el mecanismo de acción de la MK. En esta Tesis, se decidió caracterizar en profundidad uno de los mutantes afectados en ntrY, GRS577. En el mutante GRS577, el transposón interrumpe la secuencia del gen ntrY, el cual codifica una histidina quinasa de membrana que actúa como sensor del sistema regulador de dos componentes NtrY/NtrX. Este sistema, el cual ha sido estudiado en diversas especies de bacterias (Atack et al. 2013; Carrica et al. 2012; Ishida et al. 2002; Nogales et al. 2002; Pawlowski et al. 1991), se ha asociado al control del metabolismo nitrogenado. Recientemente, se ha descrito que el regulador NtrX, pero no NtrY, controla movilidad y producción de succinoglucano (EPS I) en S. meliloti, y es necesario para la fijación de nitrógeno (Wang et al. 2013). GRS577 presenta defectos en movilidad en superficie y swimming como consecuencia de estar afectado en la síntesis de flagelos. Además, súper-produce EPS I, el cual es responsable de un incremento en la formación de biofilm pero no de la insensibilidad del mutante a 2-TDC. GRS577 también muestra una morfología alterada y mayor susceptibilidad a estrés salino. Aunque el transposante induce la formación de nódulos fijadores de nitrógeno en alfalfa, exhibe menor capacidad competitiva por la ocupación de los mismos que probablemente es consecuencia de su menor capacidad para colonizar las raíces de alfalfa. No obstante, está igual de afectado en la nodulación que la cepa silvestre en presencia de 2-TDC. Experimentos de complementación revelaron que tanto ntrY como ntrX son responsables de los fenotipos mostrados por el mutante ntrY::Tn5. La sobre-expresión ectópica del regulador maestro flagelar VisNR fue suficiente para restaurar el defecto en movilidad y en competitividad del transposante. Un análisis transcriptómico confirmó la expresión diferencial de genes exo y genes flagelares, y permitió demostrar que el sistema NtrY/NtrX contribuye a la expresión óptima del gen nifA y de los genes de desnitrificación en condiciones microaeróbicas en respuesta a la presencia de nitrato. En resumen, la caracterización fenotípica del transposante GRS577 ha permitido extender el conocimiento sobre el papel complejo que juega el sistema NtrY/NtrX en la biología de S. meliloti, controlando fenotipos relevantes tanto para el estado de crecimiento en vida libre como para la interacción simbiótica con alfalfa. En la segunda aproximación abordada en la Tesis con el objetivo de seguir indagando en el mecanismo de acción de la 2-TDC, y recopilada en el Capítulo 3, se procedió a la identificación de genes de S. meliloti GR4 cuya expresión se viese alterada significativamente en presencia de la MK utilizando la tecnología de las trampas génicas. Dicha estrategia se basó en someter a la cepa GR4 a una mutagénesis generalizada con un transposón Tn5 modificado, el cual contenía el operón luxCDABE que codifica el enzima luciferasa. Dicho operón nos serviría como construcción reportera para monitorizar la expresión en presencia o ausencia de 2-TDC del gen afectado por la inserción del transposón a través de la medición de la intensidad lumínica emitida por el correspondiente mutante. Gracias a esta estrategia hemos podido identificar una bomba de extrusión de la familia RND (del inglés, Resistance, Nodulation, Cell Division), codificada por el operón smb20347-smb20346-smb20345, cuya expresión se activa en presencia de 2-TDC. El transposante afectado en esta bomba, GTR3033, en el que el Tn5 interrumpe la secuencia de smb20345, mostró altos niveles de luminiscencia como consecuencia de la inducción por la MK. Nuestros resultados indican que la región promotora encargada de dirigir la transcripción de los genes de la bomba está situada aguas arriba de smb20347, el gen codificante del teórico regulador transcripcional TetR que actuaría como represor de la bomba en ausencia de la señal efectora. Además, hemos comprobado que la expresión de esta bomba está modulada por la cantidad de 2-TDC aplicada, existiendo un rango de concentraciones óptimo, y que también la forma de aplicación de la MK (como volátil o disuelta) tiene efectos en la inducción de la misma. Por otro lado, hemos podido constatar la influencia de la estructura química en la capacidad para inducir la actividad promotora de smb20347. Así, metilcetonas y aldehídos de cadena larga (C12-C16) muestran mayor actividad inductora. Del mismo modo, acil-homoserina lactonas formadas por grupos acilo de cadena larga con un sustituyente carbonilo también inducían la expresión de la bomba, es decir, cadenas muy similares estructuralmente a las MK. Nuestros resultados muestran además que la inserción del transposón en smb20345 da lugar a una menor respuesta a la 2-TDC, medida en términos de expansión de la colonia en medio semisólido, sin afectar al crecimiento de S. meliloti en presencia o ausencia de 2-TDC ni a su capacidad para desplazarse en superficie o mediante motilidad swimming. En cambio, la capacidad simbiótica de la bacteria no se ve alterada por la mutación en la bomba, ya que el transposante GTR3033 es capaz de inducir la formación de nódulos, así como también, de competir por la ocupación de los mismos de forma tan eficiente como la cepa silvestre. Tampoco su aparente insensibilidad a 2-TDC produce ningún efecto en la nodulación en presencia de dicho compuesto, de forma que plantas de alfalfa inoculadas con el mutante en la bomba siguen experimentando el mismo retraso que las inoculadas con la cepa silvestre GR4 si se adiciona la MK. Aunque es necesario seguir investigando en mayor profundidad, los resultados obtenidos de estos análisis apuntan a que esta bomba participaría en el transporte de compuestos con función señalizadora en bacterias, lo que abre la posibilidad del diseño de un biosensor que permitiría la detección de este tipo de moléculas en distintos sistemas biológicos. Bibliografía Amaya-Gómez C.V., Hirsch A.M. & Soto M.J. (2015) Biofilm formation assessment in Sinorhizobium meliloti reveals interlinked control with surface motility. BMC Microbiol 15, 58. Antonious G.F. (2013) 2-undecanone and 2-tridecanone in field-grown onion. J Environ Sci Health B 48, 302-7. 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