Evaluación toxicológica de cilindrospermopsina mediante modelos experimentales in vivo e in vitroDaños producidos por estrés oxidativo y potencial efectividad de n-acetilcisteína para contrarrestarlos

Abstract

Las cianobacterias han ido adquiriendo gran importancia a lo largo de los años debido a su capacidad de formar floraciones o ¿blooms¿, las cuales pueden llegar a ser tóxicas debido a la producción de cianotoxinas, por lo que se han convertido en una preocupación a nivel mundial en materia de contaminación ambiental, toxicológica, sanitaria y económica, ya que pueden afectar tanto a animales y plantas como a seres humanos. La Cilindrospermopsina (CYN) es una de estas cianotoxinas, citotoxina que ha demostrado en roedores in vivo tener acción hepato y nefrotóxica, además de afectar a otros órganos, como pulmón, corazón, estómago, glándulas adrenales y sistemas vascular y linfoide. Además, se ha visto que es hepatotóxica e irritante en humanos. Se ha documentado que la CYN inhibe la síntesis de proteínas, interfiere la síntesis de glutatión reducido (GSH) y es genotóxica, aunque los estudios que se centran en ella aún son escasos. Debido a que la principal vía de entrada de CYN en el organismo es la oral, por ingestión de aguas y alimentos contaminados, consideramos de importancia el estudio de los efectos tóxicos de CYN sobre el tracto gastrointestinal (GI) y el tejido endotelial humano, ya que la CYN se absorbe a nivel GI y se distribuye por el resto del organismo a través de la sangre. Para ello, se emplearon como modelo experimental in vitro la línea celular intestinal humana Caco-2, modelo enterocítico in vitro más usado, establecido a partir de un carcinoma de colon humano, y la línea celular endotelial humana HUVEC, establecida a partir de endotelio vascular de cordón umbilical, las cuales imitan al sistema in vivo, permitiendo la medida de marcadores y actividades bioquímicas de interés. Los efectos tóxicos producidos por CYN en ambas líneas celulares fueron estudiados durante 24 y 48 horas de exposición para los ensayos de citotoxicidad basal y morfológicos, y durante 24 horas de exposición para los ensayos de estrés oxidativo, ya que no existen estudios sobre estas líneas celulares que traten la generación de estrés oxidativo por parte de la CYN. Los resultados de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células Caco-2 y HUVEC a los efectos tóxicos de la CYN está influenciada tanto por el tiempo de exposición, como por la concentración a la que se expusieron las células, siendo la línea celular HUVEC la más sensible de las dos. El bioindicador más sensible a la acción tóxica de la CYN en la línea Caco-2 fue la reducción de la sal de tetrazolio (MTS), mientras que en la línea celular HUVEC fue el ensayo de captación de rojo neutro (RN). En cuanto a los resultados de estrés oxidativo, se comprobó que ambas líneas celulares sufrían un incremento de las especies reactivas de oxígeno (ERO) a la vez que un descenso en los niveles de GSH y de la actividad ¿-glutamilcisteina sintetasa (GCS), enzima limitante de la síntesis de GSH, a dosis de CYN bajas; a las dosis más elevadas, estos marcadores se veían incrementados y se reducía la cantidad de ERO. Las principales alteraciones morfológicas observadas en la línea celular Caco-2 fueron degeneración lipídica, daño mitocondrial y segregación nucleolar con núcleos alterados, mientras que en la línea celular HUVEC, se observaron principalmente segregación nucleolar con núcleos alterados, aumento del número de gránulos secretores, degeneración del aparato de Golgi y apoptosis Los resultados de estos experimentos han dado lugar a las siguientes publicaciones: BIOCHEMICAL AND PATHOLOGICAL TOXIC EFFECTS INDUCED BY PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE HUMAN CELL LINE CACO-2 (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Water Research, en revisión) ALTERATIONS OBSERVED IN ENDOTHELIAL HUVEC CELL LINE EXPOSED TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Archives of Toxicology) Siguiendo con los estudios in vitro y comprobados los efectos tóxicos de la CYN sobre las líneas celulares humanas, quisimos investigar el efecto que podría tener sobre la línea celular hepática del ciprínido Poeciliopsis lucida, PLHC-1, ya que, hasta la fecha, los estudios sobre la toxicidad de la CYN en modelos piscícolas tanto in vitro como in vivo son muy escasos, a pesar de su posible exposición al compartir hábitat. Para tratar esta cuestión, se realizaron nuevamente ensayos de citotoxicidad basal (24 y 48 horas) y de estrés oxidativo (24 horas). Los ensayos de citotoxicidad basal mostraron que la sensibilidad de las células PLHC-1 a los efectos tóxicos de la CYN era dependiente tanto de la concentración como del tiempo de exposición, siendo el bioindicador más sensible el contenido proteico total (PT). Se comprobó que la línea celular PLHC-1 era la menos sensible de las tres líneas celulares ensayadas. Con respecto a los ensayos de estrés oxidativo, se observó un aumento de la producción de ERO así como un descenso en los niveles de GSH y de la actividad de la enzima GCS. Los resultados de este experimento dieron lugar a la siguiente publicación: TOXICITY AND GLUTATHIONE IMPLICATION IN THE EFFECTS OBSERVED BY EXPOSURE OF THE LIVER FISH CELL LINE PLHC-1 TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Ecotoxicology and Environmental Safety 74, 1567-72) La CYN es una cianotoxina que se encuentra, en gran parte, de forma libre disuelta en el medio, por lo que un gran número de organismos acuáticos (fitoplancton, zooplancton, plantas y animales) pueden entrar en contacto con ella. Por ello, y una vez conocidos los efectos tóxicos que produce en los modelos celulares in vitro, consideramos de gran importancia investigar los efectos y repercusiones de dicha toxina in vivo sobre tilapias (Oreochromis niloticus), ya que es una especie de pez que crece en aguas susceptibles de contaminación por CYN, y además cada vez está cobrando mayor importancia como fuente de alimento para humanos. Nuestro estudio se centró en investigar la inducción de estrés oxidativo como mecanismo de toxicidad asociada a CYN en función de la vía de exposición y el tiempo de sacrificio, así como los posibles daños histopatológicos que podía ocasionar. Para este fin, se intoxicaron tilapias con una dosis única de 200 ¿g CYN pura/kg p.c. (seleccionada en base a estudios previos) por vía oral, mediante sonda gástrica (gavage) y por vía intraperitoneal (i.p.). Tras 24 horas y 5 días, los peces fueron sacrificados y se analizaron diferentes actividades enzimáticas, nivel de peroxidación lipídica (LPO), oxidación de proteínas y ADN, y contenido de GSH. De esta forma, comprobamos que la CYN producía un incremento de la actividad NADPH oxidasa, de los niveles de LPO y de la oxidación de proteínas, no producía oxidación del ADN en las condiciones ensayadas, y disminuía el contenido de GSH y la actividad GCS, lo que indica la importancia de estas enzimas en la patogenicidad de la CYN. Además, se comprobó que el tiempo de sacrificio influía más en los resultados que la vía de administración de la toxina, ya que los peces sacrificados a los 5 días tras la exposición presentaban la recuperación de algunos de los biomarcadores estudiados, mientras que otros parámetros mostraban mayor afectación. Al mismo tiempo, nos planteamos el estudio de las variaciones en la expresión génica de las enzimas Glutatión peroxidasa (GPx) y Glutatión-S-transferasa (GST), así como la abundancia relativa de GST en hígado y riñón bajo las mismas condiciones. El objetivo principal fue evaluar la alteración de los niveles de ARNm y la abundancia de proteínas de estas enzimas, ya que estos marcadores pueden proporcionar una información temprana sobre el estado del pez. Los resultados mostraron que estos parámetros se veían más afectados por la vía i.p. y en peces sacrificados tras 5 días. Por último, también se estudiaron los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos (hígado, riñón, intestino, corazón y branquias), comprobándose que no se producía una recuperación de las lesiones histopatológicas inducidas a los 5 días de la exposición a la toxina, lo cual demuestra la toxicidad retardada de CYN en este modelo experimental. Los resultados de este experimento dieron lugar a las siguientes publicaciones: OXIDATIVE STRESS RESPONSES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN UNDER LABORATORY CONDITIONS: INFLUENCE OF EXPOSURE ROUTE AND TIME OF SACRIFICE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aquatic Toxicology 105, 100-6) INFLUENCE OF THE EXPOSURE WAY AND THE TIME OF SACRIFICE ON THE EFFECTS INDUCED BY A SINGLE DOSE OF PURE CYLINDROSPERMOPSIN ON THE ACTIVITY AND TRANSCRIPTION OF GLUTATHIONE PEROXIDISE AND GLUTATHIONE-S-TRANSFERASE ENZYMES IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Toxicon) TIME-DEPENDENT HISTOPATHOLOGICAL CHANGES INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) AFTER ACUTE EXPOSURE TO PURE CYLINDROSPERMOPSIN BY ORAL AND INTRAPERITONEAL ROUTE (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Aceptado en Ecotoxicology and Environmental Safety) Tras confirmar la producción de estrés oxidativo como mecanismo de acción tóxica de la CYN tanto in vitro como in vivo, quisimos investigar el efecto protector de la N-acetilcisteína (NAC), precursor del GSH, frente al daño oxidativo e histopatológico que pueden inducir tanto la CYN pura como liofilizados de cianobacterias productoras de CYN (+CYN) en tilapias. Los peces fueron pretratados con 0, 22 y 45 mg NAC/pez/día durante una semana, tras la cual fueron expuestos a una dosis única de, o bien 200 ¿g/kg pc de CYN pura o bien 200 ¿g/kg pc de CYN procedente de un liofilizado de Aphanizomenon ovalisporum, mezcladas con el alimento, y se sacrificaron a las 24 horas. Al igual que en el experimento anterior, se analizaron diferentes actividades enzimáticas, niveles de LPO, oxidación de proteínas, contenido de GSH, expresión génica de las enzimas GPx y GST y los daños histopatológicos producidos en los diferentes órganos. Los resultados mostraron un papel protector de la NAC en función de la dosis y el marcador biológico analizado. Así, sobre las actividades enzimáticas mejoraba la situación de estrés inducida por la CYN, tanto en el caso de la toxina pura como en el liofilizado de las células productoras de CYN (+CYN). Con respecto a la LPO se observa una recuperación de los valores basales y en cuanto al contenido de GSH se recuperaban los niveles tras la depleción sufrida en los grupos intoxicados con CYN sin pretratamiento. Además, estudiamos las repercusiones que la NAC podía ocasionar sobre el hígado, riñón, intestino, corazón y branquias a nivel histopatológico. Los resultados mostraron como la CYN procedente del liofilizado de A. ovalisporum producía daños más severos en los diferentes órganos en comparación con la CYN pura. Además, también se comprobó que la NAC ejercía un efecto protector frente a la CYN, reduciendo los daños observados. Por tanto, puede considerarse la NAC como un agente quimioprotector útil en la prevención de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. Los resultados de estos experimentos han dado lugar a una solicitud de patente, y a la siguiente publicación: PROTECTIVE ROLE OF DIERTARY N-ACETYLCYSTEINE ON THE OXIDATIVE STRESS INDUCED IN TILAPIA (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSED TO CYLINDROSPERMOPSIN (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Enviado a Aquatic Toxicology) Por último, consideramos fundamental el inicio de las investigaciones para conocer el impacto de la CYN sobre plantas de consumo humano, ya que tras revisar la bibliografía científica, se constata la ausencia casi total de información disponible. Para ello, se comenzó con un análisis previo enfocado desde un punto de vista molecular para, de esta forma, poder identificar genes/proteínas implicados en el proceso de producción de toxicidad. Quisimos caracterizar la expresión proteica de la planta de tomate (Solanum lycopersicum) expuesta a CYN pura y extractos de CYN procedentes de cultivos de A. ovalisporum. Se emplearon geles de dos dimensiones (2DE) para el análisis proteómico de hojas de tomate. Además, se comprobó que la toxina puede ser el principal factor responsable del estrés fisiológico observado en las plantas, aunque existen otras moléculas bioactivas sintetizadas por las células de A. ovalisporum que podrían contribuir a la toxicidad observada. Los resultados de este experimento han dado lugar a la siguiente publicación: ALTERATIONS ON PROTEIN EXPRESSION INDUCED BY CYLINDROSPERMOPSIN IN TOMATO PLANTS (SOLANUM LYCOPERSICUM) (Gutiérrez-Praena y col., 2011. Pendiente de envío) Para finalizar, teniendo en cuenta los resultados derivados de los experimentos realizados en la presente Tesis Doctoral, queda demostrada la validez de las técnicas in vitro e in vivo empleadas para la evaluación toxicológica de la CYN, contribuyendo de esta forma a ampliar el conocimiento que actualmente podemos encontrar en la bibliografía científica con respecto a esta cianotoxina.