Síntesis y evaluación de péptidos y derivados peptídicos con aplicaciones significativas en desarrollo de fármacos, biotecnología y diagnosis

Resumen

Esta tesis doctoral aborda el estudio e importancia de los péptidos en distintos campos científicos y su aplicabilidad, siendo el gran abanico de posibilidades y la enorme capacidad de aplicación a diferentes niveles, el principal incentivo para su estudio. Además, se recoge una breve introducción a la síntesis en fase sólida, así como de trabajos previos y conclusiones importantes en estos campos. La presente memoria se divide principalmente en tres capítulos, en los que se han sintetizado derivados peptídicos con diferentes fines, en los que se puede observar esta gran aplicabilidad. En cada capítulo se detallan los objetivos de consecución de las diferentes secuencias peptídicas, como su aplicabilidad y evaluación La síntesis de los compuestos en los que se ha basado este trabajo, se ha llevado a cabo en fase sólida, esta es una química versátil, que permite introducir modificaciones estructurales en la secuencia diseñada, de manera sencilla, para así mejorar las propiedades de los compuestos, haciéndola una firme candidata para la obtención de compuestos de diferente naturaleza compatibles con ella, haciendo de esta, una síntesis química aplicable en diferentes campos. Poder diseñar secuencias basándonos en una diana biológica, secuencias conocidas, o mediante estudios de afinidad, junto con imaginación y creatividad, han hecho de esta síntesis una estrategia que puede ser aprovechada para generar péptidos únicos, que nos permitan optimizar una respuesta biológica, y regularla mediante la intervención de secuencias afines a dianas biológicas e incluso obtener resultados en diferentes ámbitos. Así como el reto de diseñar, sintetizar y evaluar moléculas con capacidad de superar las limitaciones físicas y químicas de las membranas celulares y/o tejidos, que nos permitan el paso celular, detección, inducción, control de funciones e incluso la manipulación de reacciones químicas en el interior celular. El capítulo 1 describe la síntesis de distintos péptidos y glicopéptidos biológicamente activos, con el fin de mediar como inhibidores a través de las interacciones específicas proteína-proteína mediadas por el dominio PDZ de la enzima Óxido Nítrico Sintasa (nNOS). El trabajo contenido en este capítulo es continuación de la Tesis Doctoral defendida por la Dra. Ana María Pérez López (Universidad de Granada, 2010) La secuencia de reconocimiento de la proteína PDZ-nNOS, ha llevado al diseño, síntesis y evaluación de una variedad de compuestos capaces de actuar como inhibidores de la interacción proteína-proteína, mediadas por este dominio. Este tipo de péptidos tiene capacidad para intervenir en las rutas bioquímicas relacionadas con la producción de óxido nítrico (NO), por lo que tienen elevada importancia desde el punto de vista terapéutico y farmacológico por su potencial uso como neuroprotectores. La secuencia peptidica de partida ha sido descrita y sintetizada en la tesis doctoral defendida por la Dra. Ana María Pérez López (Universidad de Granada, 2010). Con el fin de permitir y mejorar el transporte y distribución de estos péptidos a través del sistema nervioso central (SNC) y cruzar la barrera hematoencefálica (BHE), que limita este paso, se llevó a cabo la glicosilación de los compuestos, basándonos en estudios previos en los que mediante la unión a carbohidratos, el transporte a través de la BHE se veía favorecido y describían que la formación de derivados O-glicosídicos , y a su vez los derivados de D-glucosa, son los más activos y daban lugar a mejores resultados. A su vez, para mejorar el paso a través de las membranas celulares y así observar la actividad, dichas secuencias peptídicas se modificaron estructuralmente con derivados de polietilenglicol (PEG) para favorecer su soporte sobre nanopartículas magnéticas de óxido de hierro (magnetita), que debido a sus características físico-químicas constituyen uno de los sistemas de transporte de fármacos más prometedores, dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología. La evaluación de la viabilidad celular, se llevó a cabo mediante ensayos de citotoxicidad a través del método MTT y la actividad neuroprotectora de estos compuestos se llevó a cabo in vivo sobre células neuronales de las líneas SH-SY5Y y SK-NBE(4) de neuroblastoma humano, las cuales expresan el receptor NMDA. La evaluación biológica la realizó el Profesor Rafael Salto y la Profesora María Dolores Girón (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Universidad de Granada), mientras que la penetrabilidad celular, fue evaluada en estas mismas líneas celulares en el laboratorio biológico de la escuela de Química de la Universidad de Edimburgo, durante una de mis estancias doctorales en dicha universidad. Los estudios de afinidad se llevaron a cabo in vitro, sobre el dominio PDZ y GST-PDZ aislados, mediante estudios STD y SPR. . Los estudios SPR se realizaron en un instrumento SPR Biacore propiedad de la empresa GE Healthcare, durante una demostración en el CIC de la Universidad de Granada. El uso del instrumento se realizó por personal especializado de la empresa El capítulo 2, describe el desarrollo de una variedad de ligandos de carácter peptídico, para llevar a cabo la formación de complejos de Paladio in situ capaces de catalizar reacciones de acoplamiento cruzado (cross coupling) mediadas por este metal. Éstas son consideradas de las reacciones más importantes en síntesis orgánica, debido a que permiten la conexión de dos fragmentos mediante la formación de enlaces Carbono-Carbono o Carbono-heteroátomo. De entre estas cabe destacar para la evaluación de la actividad de estos compuestos, el uso de la reacción de Suzuki-Miyaura. La importancia de este trabajo, radica en el descubrimiento de ligandos afines a este metal, el cual media en numerosas reacciones de gran relevancia en síntesis orgánica, contando con las numerosas ventajas de que sean ligandos de carácter peptídico, capaces de remplazar a los actuales ligandos basados en fosfinas debido a que son compuestos más estables, mejoran el rendimiento de reacción, minimizan la cantidad de metal usado en este tipo de reacciones. Son compuestos sencillos de sintetizar y manipular, viéndose a su vez todo ello favorecido por el bajo coste de reactivos y la minimización en los tiempos de producción. En el capítulo 3, se detalla el desarrollo de una librería de sensores para monitorizar in situ la actividad enzimática de la Caspasa-3. Estas enzimas juegan un papel esencial durante la apoptosis celular, proceso implicado en enfermedades como el cáncer y enfermedades autoinmunes, y a su vez son capaces de interaccionar específicamente con proteínas involucradas en el ciclo celular. Por tanto, el hecho de conocer el comportamiento de la apoptosis en estas células cancerígenas podría ser útil para la diagnosis y/o búsqueda de un tratamiento exitoso. Así se han sintetizado y evaluado, una variedad de compuestos basados en sistemas de transporte celular, que incluyen una carga de origen peptídico que contiene enlaces hidrolizables biológicamente, permitiendo la liberación de esta en el medio celular. Estos se encuentran marcados por moléculas fluorescentes que forman un sistema FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) que absorben en la región del espectro del infrarrojo cercano (NIR) (bandas de absorción 12500-4000cm-1), con objeto de poder usarlos como técnica de detección in vivo en longitudes de onda capaces de ser observadas en el visible por el ojo humano permitiendo la detección de funciones celulares, y en este caso, el cáncer. Se ha evaluado la eficacia del paso a través de las membranas celulares mediante la técnica de citometría de flujo (FACs) en células HEK, y un análisis cualitativo de la penetrabilidad celular se llevó a cabo mediante la observación en un microscopio Leica SP5 Confocal. La evaluación de la afinidad, frente Caspasa-3 y caspasa-7 debido a su similitud estructural, con el fin de encontrar una secuencia específica de unión hacia la enzima Caspasa-3, y el seguimiento de la farmacocinética de la reacción se llevó a cabo mediante un Plate Reader (Biotek Synergy HT), recogiendo las señales fluorescentes correspondientes a las longitudes de onda de excitación y emisión, cada dos minutos, durante 1hora. La capacidad de detección de la actividad enzimática dentro de las células nos puede proveer de información vital, para la detección temprana de enfermedades y para desarrollo de tratamientos efectivos. Este estudio se realizó frente a la línea celular derivada de cáncer de cuello uterino HeLa (siglas que provienen del nombre de Henrietta Lacks, de la cual provenían las células originales de este carcinoma cervical) y la línea celular de cáncer de riñón HEK (de sus siglas en inglés, Human Embryonic Kidney cells). Este trabajo se llevó a cabo gracias a la ayuda concedida del Ministerio de Economía y Competitividad, para la financiación de estancias breves del personal investigador en formación con código EEBB-I-13-07131, con el fin de mejorar mi formación e impulsar el desarrollo de mi tesis doctoral. Se realizó bajo la supervisión del Profesor Mark Bradley. (Professor of High-Throughput Chemical Biology, School of Chemistry, University of Edinburgh)