Role of thymidine kinase in pyrimidine nucleotide homeostasis in trypanosoma brucei

Resumen

Trypanosoma brucei es un protozoo flagelado perteneciente a la clase kinetoplastida y responsable de la tripanosomiasis Africana o enfermedad del sueño en humanos y de la nagana en animales (Simarro et al., 2012). La OMS estima en 10.000 el número de casos nuevos que se producen cada año (WHO, 2016). La enfermedad tiene un impacto sanitario notable y la aparición de resistencias a los fármacos utilizados en la clínica constituye un problema para el control. En las últimas décadas T. brucei ha sido intensamente estudiado con la finalidad de encontrar nuevas terapias antiparasitarias que superen las deficiencias existentes en relación con la baja eficacia y la toxicidad. La identificación de aspectos singulares del parásito con respecto al hospedador humano podría proporcionar vías para la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el diseño de inhibidores. El metabolismo de nucleótidos ha sido una fuente de dianas terapéuticas en muchas enfermedades debido a que el equilibrio y el control del pool de desoxirribonucleótidos (dNTPs) son esenciales para una correcta replicación y reparación del DNA. En relación con los diferentes dNTPs, tiene especial relevancia el mantenimiento de las proporciones relativas de desoxiuridina trifosfato y desoxitimidina trifosfato (dUTP/dTTP) ya que la mayoría de las polimerasas no son capaces de diferenciarlos y pueden incorporar de manera indiscriminada una u otra en la cadena naciente de DNA. La mayoría de las especies poseen dos rutas metabólicas que contribuyen a la formación y mantenimiento del pool de dNTP: la ruta de síntesis de novo y la ruta de recuperación o salvamento (Reichard, 1988). En T. brucei el dUTP constituye un intermediario tanto en la síntesis de novo como en la vía de recuperación del metabolismo de pirimidinas, y su incorporación al DNA naciente resulta deletérea (Vertessy and Toth, 2009). La eliminación del dUTP es llevada a cabo por la desoxiuridina trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa) una enzima que en tripanosomátidos cataliza la hidrólisis del dUTP y desoxiuridina difosfato (dUDP) a (desoxiuridina monofosfato) dUMP, produciendo el único precursor para la síntesis de novo de timidilato, y que además mantiene una baja relación dUTP/dTTP, impidiendo así la incorporación de uracilo durante la replicación. La depleción de la dUTPasa en T. brucei genera un desequilibrio en el cociente dUTP/dTTP, fragmentación cromosómica y pérdida de viabilidad, fenotipo que se revierte tras la adición al medio de elevadas concentraciones de timidina (dThd) (Castillo-Acosta et al., 2013; Castillo-Acosta et al., 2008). Mientras que la biosíntesis de dTTP a través del dUMP ha demostrado ser necesaria para la sobrevivencia del parasito in vitro (Sienkiewicz et al., 2008), la relevancia de la formación de dTTP a través de la ruta de recuperación de timidina no ha sido evaluada en profundidad. Las timidina kinasas (TKs, EC 2.7.1.21) son enzimas claves en la ruta de salvamento de pirimidinas que catalizan la trasferencia de un -fosfato desde el ATP a la timidina para la formación de desoxitimidina monofosfato (dTMP). ATP+dThd□(↔┴TK ) ADP+dTMP El dTMP formado es fosforilado hasta dTTP para ser utilizado en la síntesis de DNA durante la replicación (Birringer et al., 2005; Birringer et al., 2006). Hay dos tipos de TKs, I y II, que presentan diferencias tanto estructurales como de especificidad de sustrato. Pertenecen al tipo I la TK de Herpes simplex virus (HSV-TK) y la TK mitocondrial humana (hTK2) y su singular especificidad de sustrato se ha explotado en el desarrollo de terapias antivirales. Las TKs de tipo II están presentes en muchos organismos incluyendo los parásitos protozoos T. brucei y especies de Leishmania, en plantas, en mamíferos (isoforma citosolica), bacterias y algunos virus (Ranjbarian et al., 2012; Timm et al., 2015). La mayoría de las TKs de tipo II son altamente específicas para la dThd y la desoxiuridina (dUrd). A diferencia de las demás TK de tipo II, la TK de T. brucei se aleja de la típica forma homodímero/homotetrámero. De hecho, es una proteína que presenta dos dominios homólogos a la hTK1 en tándem en una única cadena. La proteína completa se presenta como un pseudo-dímero y los dos dominios corresponden a dos subunidades de una típica TKII. En este trabajo se ha analizado el papel de la ruta de recuperación de pirimidinas en mutantes deficientes en dUTPasa y su aportación al mantenimiento del cociente dUTP/dTTP. En concreto se ha investigado el requerimiento de pirimidinas tras la suplementación con varios nucleósidos y nucleobases. Aparte de la timidina, solo la 5-metil desoxicitidina, que tras su desaminación genera timidina, revierte el fenotipo letal lo que pone de manifiesto el papel central de la vía de recuperación de timidina en la supervivencia del parásito. Estas observaciones sugieren que la dUTPasa juega un papel fundamental en la actividad house-cleaning de nucleótidos no canónicos (dUTP) más que en la síntesis de novo de timidilato. Además se ha demostrado que parásitos deficientes en dUTPasa no son capaces de generar infecciones en un modelo murino demostrándose la importancia de la enzima también in vivo. El trabajo de tesis también incluye un estudio detallado del papel de la timidina kinasa en homeostasis de nucleótidos y supervivencia en T. brucei. La depleción de la proteína mediante RNA de interferencia ha demostrado que la enzima es necesaria para proliferación y progresión del ciclo celular. De hecho, la disminución de TK genera daños en el DNA, bloqueo del ciclo celular en las fases S y G2M y lisis celular. Adicionalmente, en ausencia de TK los niveles de dTTP disminuyen de forma drástica poniendo de manifiesto su papel central en el mantenimiento del cociente dUTP/dTTP. Tb TK es también esencial para la sobrevivencia del parásito in vivo, ya que en ausencia de la enzima, T. brucei no es capaz de producir infección en ratones. El análisis de la localización celular de la proteína reveló que TK en T. brucei se sitúa principalmente en el núcleo y parcialmente en el citosol a diferencia de otras TKs de tipo II que en mamíferos se localizan sobre todo en el citoplasma. La enzima presenta una regulación de los niveles de expresión a lo largo del ciclo celular lo que ocurre muy probablemente a nivel post-transcripcional. Así, TbTK está significativamente sobre-expresada durante las fases S y G2. Por otra parte la distribución relativa entre los compartimentos nuclear y citosólico también se modula a lo largo del ciclo celular siendo el porcentaje de localización nuclear también máximo durante la fase S. Por último se ha estudiado el comportamiento de TK frente al daño genotóxico. Para ello formas sanguíneas de T. brucei fueron tratadas con diferentes agentes que producen daño en el DNA como la doxorubicina o el aducto dietilenetriamina/óxido nítrico (DETA-NO) que libera oxido nítrico. Estos estudios han demostrado que tanto la expresión como la localización de TK se modulan en respuesta al daño genotóxico, lo que va acompañado de cambios concomitantes en los niveles de dTTP. Los resultados sugieren un papel fundamental de la modulación de los niveles de dTTP por la ruta de recuperación vía TK en los mecanismos de reparación de DNA que operan frente al daño oxidativo o a la desaminación de bases. En resumen, el trabajo de tesis se demuestra que la ruta de recuperación de timidina a través de la fosorilación a dTMP catalizada por la TK es un proceso esencial en T. brucei necesario para el mantenimiento de la homeostasis de dTTP. Este proceso se regula a lo largo del ciclo celular y en respuesta a daño genotóxico. El establecimiento de que la enzima de T. brucei es esencial junto con las características singulares que presenta desde el punto de vista funcional y estructural diferentes a la TK humana sugiere su posible uso como una nueva diana terapéutica.