Selección y caracterización de mutantes de arabidopsis alterados en la respuesta a metales pesados

Resumen

RESUMEN 1. Introducción La acumulación de metales pesados en los suelos de áreas localizadas, debido principalmente a las actividades mineras, conduce a una disminución de la calidad del suelo y es tóxica para las plantas, dando lugar a una disminución o pérdida de la cubierta vegetal, lo que plantea un importante problema desde el punto de vista medioambiental. La fitorremediación representa una alternativa sostenible y de bajo coste para la rehabilitación de estas zonas contaminadas (Raskin, 1996), en la que se emplean plantas denominadas hiperacumuladoras de metales, con una mayor tolerancia a estos, unida a una mayor capacidad para sobrevivir en estas condiciones adversas (Pilon-Smits, 2005; Peng et al., 2009). No obstante, la fitorremediación es un proceso lento y en gran parte sin efecto debido a la fitotoxicidad de estos metales pesados en las plantas (Dhankher y col, 2011) y sólo podría ser considerada como una solución a largo plazo. Además, a día de hoy, hay pocas descripciones de los mecanismos moleculares involucrados en la percepción y señalización de metales pesados en las plantas. Así, a pesar de los avances producidos en los últimos años, centrados fundamentalmente en la entrada, translocación y efectos de metales, son pocos los genes esenciales en la tolerancia a metales pesados identificados. Un conocimiento más profundo en lo que respecta a los genes que puedan producir tolerancia e hiperacumulación para generar plantas que mejoren la entrada, transporte y secuestro de metales puede abrir nuevas puertas que incrementen la eficiencia de la fitorremediación y la conservación de suelos a través de la ingeniería genética (Cherian and Oliveira, 2005; Pilon-Smits, 2005). 2. Objetivos En este trabajo se pretende realizar una disección molecular y bioquímica de las rutas de señalización de la planta expuesta a concentraciones tóxicas de estos metales en suelos. Con ello, se pretende establecer en un futuro, estrategias biotecnológicas con fines de fitorremediación para la recuperación y conservación de suelos mineros con alta concentración de metales. Por ello, se han establecido los siguientes objetivos específicos: 1. La selección e identificación de genes esenciales implicados en la tolerancia simultánea a distintos metales pesados de suelos contaminados, a partir de una colección de mutantes de Arabidospsis thaliana L. de 6867 líneas mutantes homocigotas, con una inserción de T-DNA. 2. Caracterización fenotípica, bioquímica y nutricional de algunos de los mutantes seleccionados, así como la localización a nivel tisular y celular de las proteínas correspondientes y la especificidad de la respuesta a los diferentes metales. 3. Validación de la selección y del uso de enmiendas para la recuperación de suelos con alta concentración de metales pesados. 3. Desarrollo teórico Para llevar a cabo el primero objetivo, inicialmente se pusieron a punto las condiciones del medio de cultivo para realizar selección, considerando tres mezclas iniciales de 3 metales cada una, basadas en las condiciones de pH y los metales presentes en los suelos dos zonas mineras españolas: Riotinto, altamente contaminada y Alquife, moderadamente contaminada. Posteriormente se realizó una selección empleando las líneas mutantes de la colección de mutantes de Arabidospsis thaliana L. de 6867 líneas homocigotas con una inserción de T-DNA del instituto SALK y distribuidas por el NASC (NASC ID: N27941). Esta selección se llevó a cabo en relación a la respuesta a los metales pesados presentes en el medio de trabajo seleccionado con respecto al fenotipo silvestre (WT), adoptando como criterio la longitud de la raíz principal a los 7 días. Encontramos 74 líneas más resistentes y 46 más sensibles que el genotipo silvestre (WT) y se identificó el gen afectado por el inserto de T-DNA y la función molecular asignada según las bases de datos disponibles. Así, se clasificaron todos estos genes en base a su función metabólica, mostrando que estaban principalmente relacionados con el transporte, la modificación de proteínas y la señalización, siendo el metabolismo del ARN la categoría más representativa en los fenotipos resistentes y el metabolismo de proteínas en los sensibles. Para realizar los siguientes objetivos planteados y así verificar la selección realizada y estudiar el posible empleo de estos mutantes con fines de fitorremediación se seleccionaron varias líneas resistentes (Athpp9, Atnramp5, Atkup8) y otra sensible (Atala4), todas ellas relacionadas con el transporte de metales y se analizaron en mayor profundidad frente a la mezcla de metales pesados (Cd+Cr+Cu) y el Cd. Para ello, se han estudiado diferentes parámetros fisiológicos, expresión de los genes, el contenido de metales en sus tejidos y varios parámetros oxidativos, con el fin de profundizar en el estudio de las funciones de estos transportadores y dilucidar acerca de su posible función para la descontaminación de suelos. Con el fin de validar los resultados obtenidos, se analizaron los parámetros de crecimiento y estrés de los mutantes en una solución procedente del suelo de la mina de Riotinto con dos enmiendas diferentes. 4. Conclusiones Como resultado de este trabajo se han obtenido 120 genes que podrían estar relacionados con la resistencia/tolerancia a metales pesados para su posterior uso con fines de fitorremediación. Además, se ha caracterizado el mutante Atnramp5 y los resultados obtenidos sugieren que el transportador de Arabidopsis thaliana, NRAMP5 podría estar implicado en la translocación de Mn y Fe y como efecto colateral podría también estar involucrado en el transporte de Cd y Cr, de la raíz a la parte aérea. Además, se puede indicar que esta es la primera vez que se han estudiado las proteínas HPP9, ALA4 y KUP8 en respuesta a metales pesados y se ha determinado que las dos primeras podrían ser útiles para fitorremediación y la recuperación de suelos contaminados, ya que parecen estar involucrados en la entrada y translocación de los metales pesados desde el suelo. Asimismo, los mutantes Athpp9 y Atala4 conservan su fenotipo en presencia de un extracto de los suelos originales con dos enmiendas diferentes. El transportador KUP8 sin embargo, más que estar directamente involucrado en la entrada o translocación de los metales pesados, parece estar relacionado con la distribución subcelular de potasio o la señalización dependiente de metales pesados, que lleva a la reducción de tamaño en las plantas.