Purificación y caracterización de la actividad hidrolizante de paraoxón de hígado de rata

Abstract

Se ha puesto a punto un metodo para la purificacion de la paraoxonasa hepatica de rata. Con este metodo se ha obtenido un preparado enzimatico totalmente puro con un rendimiento de 6% una actividad especifica de 1370 mu/ml y un indice de pureza de 400. Se ha establecido la secuencia del extremo amino terminal y dos secuencias intermedias de 10 aminoacidos cada una de la paraoxonasa hepatica de rata y se han comparado con las secuencias homologas de los enzimas de suero de conejo y humano e higado de raton mostrando una gran homologia entre ellas. Mediante inmunizacion de conejos con el enzima purificado, se han obtenido anticuerpos policlonales con un titulo 1/10000 que resultaron ser especificos cuando se ensayaron frente al extracto crudo, fraccion microsomal y enzima purificado. El estudio de las actividades paraoxonasa, arilesterasa y fenilacetato esterasa a lo largo del proceso de purificacion, sugiere que los tres sustratos son hidrolizados por el mismo enzima. El enzima purificado se caracterizo bioquimicamente, con los siguientes resultados: ph optimo 8.5; considerable resistencia a la inactivacion por ph en un rango de 7 a 11 y perfil de inactivacion para todos los ph monofasico; posible implicacion de restos de histidina y lisina o tirosina en el mantenimiento de la actividad catalitica; la cinetica de inactivacion por temperatura en el rango estudiado (35-55 c), se ajusta a una ecuacion exponencial simple; la curva de velocidad de reaccion a distintas concentraciones de sustrato se ajusta a la cinetica de michaelis-menten; la km determinada a ph 7.4 y 8.5 fue de 1.96 y 1.68 respectivamente; el enzima purificado es inhibido por edta, bario, cobre, manganeso, magnesio, zinc, acetato de fenil mercurio p-hidroximercuribenzoato y mercurio; el zinc, mercurio y acetato de fenilmercurio fueron los mas potentes y el manganeso el menos efectivo; la inhibicion por mercuriales indica la presencia de grupos sh importantes para la