Apocarotenoides en la interacción sexual de phycomyces

Resumen

Objetivos de la Tesis La interacción sexual es el principal regulador de la producción de carotenos en la mayoría de los Mucorales y es esencial en los procesos industriales desarrollados para producirlos con Blakeslea y Phycomyces. Los compuestos químicos que median la sexualidad de los Mucorales y activan la carotenogénesis son derivados del caroteno ß. Esta Tesis pretende ampliar el conocimiento del proceso sexual de P. blakesleeanus, y especialmente de la ruta metabólica de los apocarotenoides. Capítulo 1 Apocarotenoides de Phycomyces Enfoque de las investigaciones El estudio de los apocarotenoides conlleva la extracción, la separación y la identificación simultánea de muchos compuestos de cultivos separados, resultantes de la siembra de esporas de una sola estirpe, y de cultivos mixtos, resultantes de la siembra de una mezcla de esporas de ambos sexos. Para ello utilizamos las estirpes silvestres NRRL1555, de sexo (-), y NRRL1554 y A56, de sexo (+), y los mutantes blancos C5, de sexo (-), y S342, de sexo (+). Estos mutantes del gen carB acumulan grandes cantidades de fitoeno, pero son incapaces de producir caroteno ß. Por lo tanto no pueden tener derivados del caroteno ß tales como los trisporoides. Se toman como derivados del caroteno ß (apocarotenoides) y entre ellos los trisporoides, los compuestos encontrados en cultivos de estirpes silvestres que no se encuentren en los de los mutantes carB. Se usaron tres clases de medios sólidos: agar mínimo, agar nutritivo y agar papa; los dos primeros se combinaron además con acetato. Estos medios se inocularon con esporas de una estirpe o de dos estirpes de sexo opuesto y se incubaron cinco días. Los materiales de partida para los análisis son extractos de los medios de cultivo obtenidos por congelación, descongelación y presión de las masas de agar. Capítulo 2 El gen triD Introducción Este capítulo contiene el aislamiento y caracterización del gen triD de la estirpe patrón de Phycomyces blakesleeanus, responsable de la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, que cataliza el paso del dihidrotrisporato de metilo a trisporato de metilo. El gen triD fue el primero de la ruta biosintética de los ácidos trispóricos que se aisló y se secuenció. El Prof. J. Wöstemeyer y sus colaboradores, de la Universidad Friedrich Schiller, de Jena (Alemania), purificaron esa deshidrogenasa de extractos crudos de micelios de Mucor mucedo de la estirpe de sexo (-) cultivados en presencia de ácidos trispóricos. Para ello fraccionaron los extractos y ensayaron la actividad enzimática, midiendo el NADPH producido por reducción del cofactor NADP durante la oxidación del sustrato dihidrotrisporato de metilo. Este sustrato había sido obtenido por metilación y reducción química de un extracto enriquecido en ácidos trispóricos de un cultivo mixto de Blakeslea trispora. Con las secuencias peptídicas diseñaron dos mezclas de oligonucleótidos que usaron como cebadores para obtener por PCR un fragmento de ADN genómico de 0,7 kb y con éste escrutaron una genoteca parcial. Obtuvieron así el gen de Mucor mucedo responsable de la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, que llamaron tdh (Czempinski et al., 1996). Los mismos cebadores permitieron obtener fragmentos del mismo gen de otros Cigomicetos (Parasitella parasitica, Absidia glauca y Blakeslea trispora). En los albores de este trabajo establecimos una colaboración con la Universidad de Jena. En las semanas anteriores a mi llegada a Jena, el grupo alemán aisló un fragmento de 983 pb de ADN del gen homólogo de Phycomyces. Para aislar este fragmento, utilizaron dos cebadores diseñados a la vista de las secuencias conservadas de Mucor y Parasitella. Capítulo 3 Expresión del gen triD Introducción Como ya disponíamos de las regiones flanqueantes, no traducidas, del gen triD, una secuencia anterior de 156 pb y otra posterior de 522 pb, nos propusimos investigar el inicio y el final de su transcripción. Analizamos también el efecto de la estimulación sexual sobre la transcripción, para ello comparamos cultivos mixtos con cultivos separados. La expresión del gen en la bacteria Escherichia coli permitió la purificación de la proteína correspondiente. Capítulo 4 Evolución del gen triD Introducción Caracterizado el gen triD de Phycomyces blakesleeanus, buscamos secuencias similares en mutantes con distintas respuestas sexuales y en estirpes naturales de Phycomyces aisladas por nosotros o presentes en colecciones internacionales. Para establecer una relación evolutiva entre las estirpes, comparamos estas secuencias génicas con las homólogas de Mucor mucedo y Parasitella parasitica, ya conocidas, y con las más parecidas a la del gen triD que se encuentran en los genomas completos de Rhizopus oryzae y Mucor circinelloides. También comparamos el gen triD y los demás presuntos genes que codifican para aldocetorreductasas de P. blakesleeanus, R. oryzae y M. circinelloides. Conclusiones 1. Los apocarotenoides se identifican fácilmente por un método genético: están ausentes de los cultivos separados o mixtos de mutantes carB incapaces de producir caroteno. 2. Se han establecido condiciones y métodos apropiados para separar los apocarotenoides. Se han identificado veinticinco apocarotenoides; el Prof. A. Fernández Barrero y sus colaboradores de la Universidad de Granada han establecido las estructuras moleculares de algunos. Tres de ellos son nuevos para la ciencia: el trispoxano y los ácidos (2E,4E)-6-hidroxi-5-metilhexa-2,4-dienoico y (2E,4E)-6-hidroxi-2-metilhexa-2,4-dienoico. 3. La detección de los ácidos hidroximetilhexadienoicos implica que el caroteno ß se rompe en tres fragmentos, que son las cabezas de tres series de compuestos, los trisporoides, formada por compuestos de 18 carbonos; los monociclofarnesanos, de 15 carbonos y los dos ácidos hidroximetilhexadienoicos, de 7 carbonos. Los compuestos de 15 carbonos no derivan de los trisporoides. 4. Los cultivos separados de tres estirpes silvestres contienen poca cantidad y escasa diversidad de apocarotenoides. Las diferencias que se observan entre ellas se deben a su sexo y a diferencias en el fondo genético. 5. El acetato y la papa, que inhiben la carotenogénesis sexual y estimulan la formación de cigosporas, presentan mecanismos de acción diferentes. El primero anula la producción de ocho apocarotenoides y el segundo de cuatro. Además, ambos inhiben considerablemente la producción de un ácido trispórico muy abundante. Entre estos compuestos deben hallarse los responsables de las acciones fisiológicas. 6. Se ha aislado y caracterizado el gen para la deshidrogenasa del dihidrotrisporato de metilo, al que llamamos triD, que cataliza el paso de dihidrotrisporato de metilo a trisporato de metilo. 7. La interacción sexual no estimula la transcripción del gen triD. 8. La reciente secuenciación completa de los genomas de P. blakesleeanus, R. oryzae y M. circinelloides ha permitido identificar el gen triD y las secuencias génicas más parecidas al mismo y establecer cladogramas para estas secuencias y las de genes homólogos ya conocidos en otros Cigomicetos. 9. La caracterización molecular de las estirpes silvestres de Phycomyces confirma la existencia de dos especies dentro de este género: P. blakesleeanus y P. nitens. Estas especies son muy distantes entre sí y muy uniformes internamente. 10. Phycomyces se encuentra más próximo a M. circinelloides que a R. oryzae. La topología de estas relaciones apoya la conservación de la familia Mucoráceas y se opone a la creación de la familia Ficomicetáceas para el género Phycomyces.