Metabolismo nucleotídico en leishmania majorcaracterización de la desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa

Resumen

El enzima desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótidohidrolasa o dUTPasa es un enzima que cataliza la conversión de dUTP hasta dUMP, liberando PPi, y que interviene en la ruta de síntesis "de novo" del timidilato, presentando también un papel esencial en el mantenimiento de la integridad del DNA en todos los organismos vivos. En esta Tesis se describe el aislamiento del gen dut de Leishmania major mediante una estrategia de complementación genética en Escherichia coli, en concreto una cepa mutante que carece de actividad dUTPasa. También se ha llevado a cabo una caracterización del gen y de la secuencia codificante de la proteína, encontrando que este enzima es marcadamente diferente al resto de las dUTPasas descritas hasta el momento, con tan solo una pequeña homología con la dCTPasa-duTPasa del bacteriófago T4. Esta gen ha sido sobreexpresado utilizando el sistema pET-11c y la proteína se ha purificado a homogeneidad en dos pasos. La caracterización posterior de este enzima mostrado que es capaz de actuar sobre dUTP y sobre dUDP, hidrolizándolos ambos hasta dUMP y liberando PPi o Pi respectivamente. El dUMP se ha caracterizado como un inhibidor competitivo de la dUTPasa de este protozoo parásito y se han determinado los parámetros cinéticos para la hidrólisis del dUTP y del dUDP. Ha sido determinado también que este enzima es capaz de complementar la deficiencia de dUTPasa en un sistema eucariota como es levadura, a pesar de la notable diferencia entre ambas dUTPasa, tanto en la secuencia primaria de aminoácidos, como en su peso molecular. La sobreexpresión en Leishmania ha permitido conocer parte de su papel biológico.