Estudio del papel del DI-gmpc en la interacción planta-bacterias fitopatógenas

Resumen

El género Pseudomonas es un grupo de bacterias que incluye aproximadamente 200 especies de las que algunas son patógenas de plantas, como los distintos patovares de P. syringae. Las bacterias pertenecientes al complejo P. syringae provocan diferentes enfermedades, con síntomas sobre todo foliares, en una amplia variedad de plantas de interés agronómico en todo el mundo. Actualmente, se han secuenciado los genomas de al menos 10 cepas del complejo, incluyendo Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto DC3000) que es e agente causal de la mancha negra bacteriana, una enfermedad foliar que provoca gran perjuicio económico sobre todo en los tomates cultivados bajo invernadero. Además de por su importancia económica, Pto posee un alto interés científico. En primer lugar, porque es fácilmente cultivable en medios de laboratorio y susceptible de manipulación genética, lo que facilita su identificación, la generación de mutantes y su estudio a nivel molecular. En segundo lugar, porque el tomate es una especie vegetal susceptible a la transformación y al análisis genético, lo que facilita la caracterización de los genes implicados en las respuestas de defensa del hospedador frente al patógeno. Por último, algunas cepas de Pto, incluida Pto DC3000, son patógenas para la planta modelo Arabidopsis thaliana, lo que proporciona un sistema modelo para el estudio de la patogénesis bacteriana y de las respuestas de defensa vegetales. Los principales factores de virulencia de Pto DC3000 son el sistema de secreción tipo III (T3SS) y la toxina coronatina. El T3SS es una nanomáquina de secreción especializada que transporta proteínas bacterianas (efectores) directamente del citosol bacteriano al citoplasma de las células del hospedador donde provocan la enfermedad alterando y/o suprimiendo las respuestas de defensa de la planta a diferentes niveles, o desencadenan una respuesta inmune exitosa si son reconocidos por las proteínas de resistencia. La coronatina es una toxina compuesta de ácido coronafácico y un derivado de isoleucina, el ácido coronámico, unidos por un enlace amida. Es un análogo estructural y funcional del ácido jasmónico que suprime los mecanismos de defensa dependientes del ácido salicílico, una señal clave en la inmunidad de las plantas, e inhibe el cierre de los estomas mediado por PAMPs, ácido abscísico u oscuridad. Además, la bacteria posee otras herramientas que no son factores de virulencia pero que contribuyen a que la infección sea exitosa, como la motilidad dependiente de flagelos, que le permite el desplazamiento en medios líquidos y sobre superficies, la producción del biosurfactante siringafactina, que contribuye a la motilidad y la síntesis de exopolisacáridos como celulosa, que favorece la formación de biopelículas. El diguanilato cíclico (di-GMPc) es un segundo mensajero ubicuo en bacterias, determinante en la regulación de la transición de un estilo de vida libre y mótil a otro sésil o en asociación formando biopelículas. Para ello, estimula la biosíntesis diversos componentes de la matriz extracelular a la vez que inhibe diversas formas de motilidad. El di-GMPc se sintetiza a partir de dos moléculas de guanosina trifosfato (GTP) gracias a la acción de diguanilato ciclasa (DGC) y se hidroliza a 5’-fosfoguanilil-(3’-5’)-guanosina (pGpG) o guanosina monofosfato (GMP) por fosfodiesterasas (PDE) específicas. La actividad DGC está asociada con el dominio GGDEF y la actividad específica di-GMPc-PDE está asociada a dominios EAL o HD-GYP. Por tanto, los niveles intracelulares de este segundo mensajero se encuentran controlados por la actividad enzimática antagonista de DGC y PDE. Pero los análisis genómicos muestran que es bastante común que los motivos GGDEF y EAL se encuentren presentes a la vez en una misma proteína junto con otros dominios que participan en la detección de estímulos ambientales y/o en la transducción de señales. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio habían demostrado que el incremento generalizado de los niveles intracelulares de di-GMPc en Pto DC3000 mediante la sobreexpresión de una DGC heteróloga de C. crescentus (PleD*) altera diversos fenotipos provocando una disminución acusada de la motilidad, un cambio en la morfología de colonia en placas con rojo Congo (colonias rojas y rugosas) y calcoflúor (mayor fluorescencia bajo luz ultravioleta) como consecuencia de un aumento en la producción de exopolisacáridos, y la formación de biopelículas en la interfase aire-líquido (Pérez-Mendoza, Aragón, HA Prada-Ramírez et al. 2014). Curiosamente, diferente de lo observado en otras bacterias donde el incremento generalizado de los niveles intracelulares de di-GMPc provocaba una disminución de la expresión de ciertos determinantes de virulencia, en Pto DC3000 no se detectaron cambios significativos en la inducción de síntomas a nivel macroscópico en tomate aunque la expresión de algunos genes del T3SS disminuía en esas condiciones. Debido al papel tan importante que desempeña el di-GMPc en bacterias que interaccionan con plantas y, en particular, en la bacteria modelo Pto DC3000, el objetivo de este trabajo de tesis ha sido estudiar en detalle a nivel celular y subcelular la interacción de Pto DC3000, y estudiar el papel de dos proteínas con dominios GGDEF y EAL en tándem: PSPTO_3886 y PSPTO_4631 (MorA) con el tomate, caracterizar los fenotipos afectados por altos niveles de di-GMPc y su efecto en la patogenicidad de Pto DC3000. La primera hipótesis de este trabajo fue que la disminución de la expresión del sistema de secreción tipo III de Pto DC3000 en respuesta a los altos niveles intracelulares de di-GMPc, no apreciable a nivel macroscópico, podría ser detectable a nivel microscópico. Por ello, se recurrió a distintas técnicas de microscopía óptica y electrónica con objeto de caracterizar las alteraciones celulares inducidas por esta bacteria en el tejido foliar del tomate tras su inoculación en condiciones controladas. En este estudio se ha establecido que la mejor estrategia para la inducción de la mancha negra bacteriana en el tomate en condiciones de laboratorio es la inoculación por rociado con suspensiones bacterianas de Pto DC3000 a títulos altos (108 ufc/ml), ya que es la que reproduce mejor los síntomas descritos en condiciones naturales. La infección inducida con Pto DC3000 reveló alteraciones en las células vegetales como la rotura de los cloroplastos, núcleos celulares con la cromatina muy condensada y cuerpos y cristales de naturaleza proteica en el citoplasma de las células del mesófilo. En las zonas más afectadas por la infección, se observaron además bacterias organizadas en grupos compactos delimitados por una estructura membranosa. Aprovechando la estrategia utilizada anteriormente en el laboratorio para incrementar artificialmente los niveles intracelulares de di-GMPc sobreexpresando PleD*, una DGC heteróloga de C. crescentus, el segundo objetivo fue estudiar el papel que desempeña el di-GMPc en la histología de Pto DC3000 y su interacción con el tomate. Para ello se han caracterizado a nivel celular y subcelular los fenotipos provocados por los altos niveles de este segundo mensajero en condiciones de laboratorio y en planta. Se ha demostrado que la diferencia en la morfología de las colonias de Pto DC3000 en ausencia y en presencia de pleD* es detectable incluso en estadios muy tempranos, cuando sólo son visibles a la lupa. Además, en presencia de pleD* también las células que forman esas colonias sufren cambios en su tamaño y son más cortas. Además, se ha comprobado que la falta de motilidad swimming en presencia de altos niveles intracelulares de di-GMPc no se debe a la ausencia de flagelos, ya que estos son perfectamente visibles al microscopio electrónico de transmisión MET y similares a los de la cepa parental, sino probablemente a que no son funcionales. Esto junto con la inhibición drástica de la producción del biosurfactante siringafactina, también explica la disminución de la motilidad tipo swarming de Pto DC3000 en presencia de altos niveles de di-GMPc. Sin embargo, no se detectaron diferencias en las alteraciones celulares producidas por Pto DC3000 (pJB3pleD*) en el tejido foliar de tomate con respecto a la cepa parental, lo que parece indicar que la disminución de la expresión de los genes hrpL y hrpA del T3SS provocada por PleD* no es suficiente para afectar significativamente la virulencia de Pto DC3000 ni modificar los daños celulares inducidos en tomate. Un fenotipo caracterizado en mayor detalle en este trabajo ha sido la formación de biopelículas en la interfase aire-líquido. Esta caracterización se llevó a cabo analizando su composición y ultraestructura así como los mecanismos involucrados en su formación utilizando cepas mutantes en genes imprescindibles para la producción de flagelos (fleQ), del biosurfactante siringafactina (syfA), y de exopolisacáridos tales como la celulosa (ΔwssBC y amrZ) y el alginato (alg8). También se empleó un mutante en el gen que codifica el regulador global GacA (gacA), que controla la respuesta al estrés, quorum sensing, el metabolismo secundario y la virulencia en Pto DC3000. Este estudio ha revelado que ninguno de los mecanismos estudiados son esenciales para la formación de biopelículas en la interfase airelíquido por Pto DC3000, pero que la presencia de flagelos y la producción de celulosa desempeñan funciones importantes. En su caracterización el uso de una malla de carbón activado como soporte para la recogida de las biopelículas de Pto DC3000 ha posibilitado su observación y estudio al microscopio electrónico de barrido (MEB). Asimismo, el desarrollo de un método para la inclusión de estas biopelículas en monocapa en bloques de agarosa he permitido su seccionamiento transversal y su estudio al MET. Como último abordaje en el estudio del papel del di-GMPc en la interacción de Pto DC3000 y el tomate, se procedió al estudio de la función de los genes PSPTO_3886 y PSPTO_4631 (morA), determinando su papel en Pto DC3000 mediante la caracterización de los fenotipos desencadenado en sus mutantes tanto en condiciones de laboratorio como in planta. No se detectó ningún efecto distintivo de PSPTO_3886 en ninguno de los fenotipos de vida libre ensayados ni en la interacción del mutante con el tomate. Sin embargo, la deleción de PSPTO_4631 (morA) sí provocó un incremento de la motilidad swarming al aumentar la producción de siringafactina. Estos resultados indican que, al menos en las condiciones ensayadas, la actividad DGC es la que prevalece en MorA de Pto DC3000. Para profundizar en la función de MorA en Pto DC3000, se expresaron in trans dos ortólogos, uno de P. aeruginosa PAO1 y otro de P. putida PNL-MK25, tanto en Pto DC3000 como en su mutante ΔmorA. Cuando se empleó morA de P. aeruginosa PAO1 no se observaron cambios en los fenotipos ensayados, pero cuando se empleó morA de P. putida PNLMK25 el efecto provocado fue semejante al observado en presencia de pleD*. Debido a que la proteína MorA (PSPTO_4631 en Pto DC3000) está ampliamente conservada dentro del género Pseudomonas y la organización génica de esa región cromosómica también (morA-glyA-2), se llevaron a cabo análisis de expresión que han demostrado que morA y glyA-2 constituyen un operón aunque dichos genes parecen poseer promotores independientes que permiten su expresión de forma autónoma. Asimismo, se ha explicado el diferente comportamiento observado con el mutante morA::Tn5, que presentaba un incremento de la motilidad tipo swimming y swarming así como flagelos más largos y abundantes que la cepa silvestre (Prada-Ramírez, 2014) y que el mutante ΔmorA (este trabajo), dada la expresión del dominio EAL de morA en el mutante morA::Tn5. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis doctoral han puesto de manifiesto la importancia del di-GMPc en Pto DC3000 y la complejidad de su red reguladora. En Pto este segundo mensajero regula la producción de celulosa, la motilidad swimming y swarming, la producción de siringafactina y la formación de biopelículas en la interfase aire-líquido, pero no afecta al desarrollo de la enfermedad en tomate.