Cristalización de proteínas en geles por métodos contradifusivos

Abstract

En esta memoria se aborda distintos problemas de la cristalización de proteínas desde un punto de vista metodológico. En primer lugar se demuestra que las técnicas contradifusivas de crecimiento de cristales (en medios gelificados, medios capilares o en condiciones de microgravedad) son las más eficientes para realizar un amplio barrido de condiciones de cristalización en una única expriencia. A partir del acoplamiento entre la precipitación de las proteínas (teoría clásica de cristalización) y el transporte de masa en un medio difusivo (leyes de Fick) se explica la evolución espacio-temporal del sistema como consecuencia de una onda de sobresaturación que recorre la cámara de precipitación. Esta metodología nos ha permitido relacionar por primera vez la calidad de los cristales, tanto limite de resolución como mosaicidad, con la sobresaturación y su variación en el espacio con el tiempo. Por otra parte se demuestra que, escogidas unas condiciones iniciales adecuadas, las técnicas contradifusivas produden los cristales de mayor calidad como se deduce de los datos de difracción de cristales de lisozima (Eng Heg White Lysozyme) crecidos en condiciones de microgravedad y en un medio gelificado con agarosa. En ambos casos el límite de resolución de los cristales es inferior a 1 A. El segundo problema de los cristales de proteínas es su alta labilidad relacionada con el elevado contenido en agua (30-80%). Para evitar las dificultades inherente a estas características se propone el reemplazamiento parcial del agua por fibras de sílice, un material fuertemente higroscópico. Por una parte se demuestra que es posible crecer cristales de proteínas en un medio con hasta un 22% v/v del gel de sílice. Por otra parte se comprueba que los cristales de proteínas incorporan todo la sílice de su entorno durante el crecimiento. Los cristales así obtenidos participan de las características físicas y quím