Análisis de las rutas cooperativas de propagación de estabilidad en el dominio SH3. Aplicación al estudio de las interacciones proteína-ligando

Résumé

En este trabajo se han estudiado las relaciones existentes entre la estabilidad termodinámica local y global de las proteínas así como entre la energética de sus interacciones internas o con ligandos externos y la transmisión cooperativa de tales interacciones a través de su estructura. Para ello se ha escogido el dominio SH3 de alfa-espectrina (SH3-Spc). Se han empleado técnicas de mutagénesis dirigida para la obtención de diferentes mutantes del dominio y se ha estudiado su estabilidad y su plegamiento mediante intercambio hidrógeno-deuterio (IHD) seguido por resonancia magnética nuclear bidimensional (RMN-2D), junto con experimentos de desplegamiento térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Por otro lado, se ha estudiado la interacción entre el dominio SH3-Spc (mutante R21A) con el decapéptido p41 (APSYSPPPPP) utilizando esepctrofluorimetría (EF), calorimetría isotérmica de titulación (ITC) y DSC combinadas con estudios de IHD seguidos por RMN-2D. Las conclusiones más importantes a las que conduce este estudio son las siguientes: 1,- Las mutaciones en diferentes puntos de su superficie producen cambios en la estabilidad global del dominio SH3-Spc de diversa magnitud y signo, determinables por DSC. Los cambios en la estabilidad global son coherentes con las predicciones teóricas existentes en la bibliografía para los efectos locales producidos en la región de la mutación. 2,- El análisis comparativo entre las estructuras de rayos X de la variante natural del dominio SH3-Spc y algunos de los mutantes (N47A, N47G, A56G y A56S) junto con el análisis de los desplazamientos químicos de RMN de la cadena principal indican que los efectos de las mutaciones sobre la estructura del dominio son muy reducidos y se limitan a la región de la mutación. 3,- El estudio de los efectos de las mutaciones sobre el IHD indica que los cambios de estabilidad local se transmiten cooperativamente en mayor o menor