Caracterización cinética y estructural de la desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dutpasa) de trypanosoma cruzi

Resumen

Trypanosoma cruzi es un protozoo parásito flagelado causante de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en países de Lationaméricana que afecta a unos 18 milones de personas y a la que unos 100 millones están expuestas. Hoy en día no existe tratamiento ni vacuna eficaz contra el prásito, por lo que una aproximaciónracional consistiría en la caracterización de enzimas blanco de acción de fármacos. La desoxiuridina 5'-trifosfato nucleótido hidrolasa (dUTPasa) catliza la hidrólisis de dUTP a dUMP y pirofosfato, desempeñando un papel biológico esencial en el control de los niveles intracelulares de dUTP e impidiendo una incorporación tóxicade uracilo al DNA. Se ha islado el gen que codifica la dUTPasa de Truypanosoma cruzi mediante un screening de complementación genética en una cepa de E. Coli deficiente en actividad dUTPasa. El gen aislado codifica una enzima carente de similitud con dUTPasa descritas en otros organismos pero con un alto grado de similitud con la secuencia de la dUTPasa del tripanosomátido Leishmania mahor. Ambas secuencias comparten ciertos dominos comunes con las enzimas dUTPasa-dCTPasa de los bacteriófagos T2 y T4. Se ha sobreexpresadola proteína recombianante en D. Coli utilizando el sistema de expresión pET. La proteína recombinante se purificó y se llevó a cabo una caracterización cinética exhaustivas, así como la deteminación de ciertas características fisico-químicas. Se determinó que la unidad funcional de la enzina es un dímero con unos parámetros cinéticos semejantes a los encotrados en otras dUTPasas en cuanto a hidrólisis del dUTP y espcificidad de sustrato. Sin embargo, el dUDP es también un sustrato de la enzima, característica que la diferencia de las dUTPasas descritas en la mayoría de organismos. LA improtancia funcional de determinados residuos conservados con las enzimas dUTPasa-dCTPasa de los bacteriófagos T2 y T4 se estudió por medio de mutagéneisis di