Modificación química de los enlaces implicados en la interacción de la fructosa-1,6-bisfosfatasa cloroplastídica con la tiorredoxina f

Zusammenfassung

La fructosa-1,6-bisfosfatasa, o FBPasa, es una enzima cloroplastídica regulada por la luz gracias al sistema ferredoxina-tiorredoxina. La tiorredoxina reducida interacciona con la FBPasa y la activa. La interacción de estas dos proteínas supone un acercamiento por fuerzas iónicas, una posible intracción hidrofóbica y, por último, una reducción de puentes disulfuro de la FBPasa más un cambio conformacional. La FBPasa es capaz entonces de hidrolizar la fructosa-1,6-bisfosfato(FBP). En esta tesis se ha llevado a cabo la estabilización covalente del complejo iónico FBPasa-tiorredoxina f con la finalidad de estudiar su interacción y los facotes que en ella influyen. Se hizo uso de un agente formador de enlaces cruzados etre grupos carboxilo y amino, la 1-etil-3-[3-(dimetilamino) propil] carbodiimida (EDC), que es hidrosoluble y de uso muy extendido, y permite, con bastante selectividad, la formación de enlaces covalentes entre grupos que en solución interaccinan iónicamente. Se demostró que el complejo covalente formando derivaba del iónico fisiológico, y pudo aislarse en condiciones desnaturalizantes. También se observó la aparición de complejos covalentes entre subunidades de FBPasa. Tanto éstos como los complejos FBPasa-tiorredoxina f fueron analizados por filtración molecular y electroforesis. Por otra parte, el intermediario disulfuro formado entre ambas proteínas se estabilizó en un medio oxidante (Cu2+). En los dos casos se llevaron también a cabo experimentos en los que la FBPasa fue sustituida por fragmentos peptídicos correspondientes a una zona expuesta de la enzima, la conocida como "bucle 170". Se demostró de esta manera la importancia de los enlaces electrostáticos entre grupos carboxilo de la región Leu154-Gly 167 de la FBPasa y grupos amino de la tiorredoxina f en la interacción de ambas proteínas, la implicación de enlaces electrostáticos en el mantenimiento de la estructura cuaternaria de