Materiales bioinspirados basados en bacterias. Aplicaciones biomédicas

Resumen

RESUMEN (Castellano) En esta Tesis Doctoral se ha pretendido indagar en aspectos concretos de la maquinaria química de una bacteria probiótica, como es Lactobacillus fermentum, muy frecuente en diferentes floras del cuerpo humano. En particular la Tesis se centra en explorar la actividad reductora de la bacteria y su capacidad para generar biofilms a través de la formación de exopolisacáridos (EPS). El conocimiento adquirido se ha utilizado para abordar problemas de salud en los que, de forma directa o indirecta, esta bacteria está involucrada. Los resultados experimentales obtenidos y la discusión de los mismos se presentan en este trabajo divididos en 7 capítulos. En el primer capítulo, se revisan los conceptos básicos del tema de investigación en el que se enmarca la presente Tesis Doctoral y la motivación de la misma en el contexto actual. Se hace una revisión bibliográfica del uso de microorganismos para la síntesis de nanopartículas metálicas, y más concretamente del uso de EPS en diferentes aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Asimismo se proponen estos EPS como plataformas para la preparación de nuevos nanomateriales con propiedades ópticas mejoradas. Por último, se introduce la cepa Lactobacillus fermentum y se revisan las aplicaciones que hoy en día encuentra dicho probiótico en nutrición y medicina. En el segundo capítulo, se ha evaluado la actividad reductora de L. fermentum usando un polioxometalato electrocrómico, que pasa de color amarillo pálido a azul intenso cuando es reducido. A partir de esta metodología simple, se ha podido demostrar que la actividad reductora de L. fermentum correlaciona con su fortaleza metabólica, de tal forma que cuando la bacteria se encuentra en medios de cultivo óptimos produce la reducción de dicho polioxometalato, mientras que en medios de cultivo pobres, este poder de reducción disminuye significativamente. Por tanto, esta metodología permite evaluar la presencia y fortaleza del probiótico en diferentes ambientes químicos, lo cual ha permitido, además, estudiar cual es el efecto de algunos fármacos sobre este probiótico. En particular se ha analizado el efecto de omeprazol y vancomicina sobre la viabilidad de dicho probiótico. Omeprazol es un fármaco utilizado masivamente en tratamientos de úlcera y gastritis, y vancomicina, uno de los antibióticos de amplio rango más consumidos. Entorno a estos dos fármacos ha existido siempre la duda de si su consumo habitual podría dañar la flora bacteriana a nivel digestivo. En este sentido, los resultados ponen de manifiesto que omeprazol no tienen ningún efecto sobre la capacidad reductora de L. fermentum y, por tanto, sobre su fortaleza. Mientras que vancomicina reduce el poder reductor de L. fermentum hasta niveles prácticamente despreciables, poniendo de manifiesto que genera una muerte o daño severo sobre esta cepa. En el tercer capítulo, se ha extendido la idea de que el cese de la actividad metabólica de las bacterias provoca una disminución de metabolitos excretados al medio para desarrollar un sensor para la diagnosis de vaginosis bacteriana. Esta infección afecta en torno al 10-15% de la población femenina mundial. En ella, la flora vaginal típica constituida por bacterias del tipo lactobacilo, que excretan ácido láctico al medio como producto mayoritario, se ve alterada por el crecimiento de bacterias patógenas de carácter anaeróbico que excretan ácidos grasos de cadena corta, siendo el ácido acético el más abundante. Los métodos actuales de diagnosis se basan en la toma de muestra para detectar las posibles bacterias patógenas presentes, lo que necesita tiempo y conlleva un coste y dificultad elevados. Se ha desarrollado un método de diagnosis basado en detectar los metabolitos típicos excretados por las bacterias. El cambio de color de amarillo a azul de un polioxometalato electrocrómico, al ser reducido en una muestra que contiene ácido láctico y tras aplicar luz ultravioleta, es la señal que indica el estado de la flora vaginal. La intensidad de color es mayor cuanto mayor es la concentración de dicho ácido y, por tanto, más “sana” es la muestra. Por tanto, se ha diseñado un método de diagnosis más rápido, barato y sencillo que los actualmente utilizados. En el cuarto capítulo, se ha dado un paso vital para entender porque las bacterias probióticas contribuyen al aumento de la absorción de hierro en el tracto gastrointestinal. La reducción de Fe(III) a Fe(II) es esencial para que el hierro sea absorbido en duodeno. Se ha determinado que la actividad ferrireductasa de L. fermentum se debe a una molécula excretada por esta bacteria, el ácido p-hidroxifenilláctico (HPLA). Mediante su capacidad para reducir Fe(III), HPLA favorece la absorción de Fe(II) a través de los canales DMT1 de los enterocitos. HPLA estaría, por tanto, actuando como lo hace la proteína ferrireductora DcytB, proteína de membrana que va ligada a los canales DMT1 en el enterocito. HPLA ha sido aislada del sobrenadante de un cultivo de L. fermentum mediante el empleo de cromatografía líquida de alta resolución y posteriormente ha sido caracterizada utilizando las técnicas de resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas. En un segundo paso se han llevado a cabo diferentes experimentos, entre ellos un experimento in vitro, para confirmar que los probióticos aumentan la absorción de Fe en el tracto gastrointestinal debido a la excreción de HPLA. Estos resultados han permitido proponer, por primera vez, un mecanismo que explique el por qué del efecto promotor de los probióticos en la absorción de hierro. Este descubrimiento abre nuevas vías para el tratamiento de la deficiencia de hierro en humanos, uno de los desordenes nutricionales más comunes y extendidos en el mundo. En el quinto capítulo, se ha llevado a cabo la identificación de los EPS que componen el biofilm de L. fermentum. Los EPS son los componentes mayoritarios en un biofilm bacteriano y están muy implicados en el desarrollo de las funciones de la bacteria. En el caso de bacterias probióticas, los EPS están relacionados con la adhesión y colonización de estas bacterias al epitelio, un proceso fundamental para que los probióticos puedan realmente llevar a cabo su papel beneficioso para la salud. Tras aislar y purificar los EPS sintetizados en un cultivo donde sacarosa es la fuente de carbono, se ha llevado a cabo su identificación mediante el empleo de resonancia magnética nuclear. De este modo, se ha determinado que los EPS de L. fermentum en estas condiciones son dos homopolisacáridos: dextran y levan. Dextran es un polímero de glucosa y levan de fructosa. Ambos polímeros presentan propiedades que los hacen ser de interés para aplicaciones biotecnológicas en la industria alimentaria y farmacéutica. En el sexto capítulo, se han aprovechado los EPS de L. fermentum como plataforma de soporte de nanopartículas de oro (AuNPs). Las AuNPs esféricas, en forma de bastón (rods) y prismas se adhieren y agregan en los EPS. Además, se ha puesto de manifiesto que los EPS son capaces de sintetizar y acoplar AuNPs por sí mismos a partir de Au(III) en disolución. Mediante UV-vis se ha determinado que la agregación de AuNPs sobre EPS genera nuevas bandas de absorción, que acompañan a la banda de resonancia del plasmón de la superficie (SPR) típica de las nanopartículas de oro. Por ejemplo, en el caso de las nanopartículas con forma de prismas, la nueva banda de absorción se sitúa a muy baja energía, sobre 1100 nm, lo que aumenta el interés de las propiedades ópticas de estos sistemas. Con el empleo de microscopía electrónica de transmisión se ha confirmado la agregación de las AuNPs en el EPS. A su vez, se ha llevado a cabo un experimento SERS para aumentar la señal Raman que tiene la rodamina B (una molécula modelo para este tipo de estudios) depositada sobre AuNPs aisladas empleando para ello estos sistemas AuNPs-EPS. En el caso del sistema AuNPs con forma de prismas sobre EPS se observa que la intensidad de la señal Raman de la rodamina aumenta dos órdenes de magnitud, mientras que para el resto de tipos de AuNPs no se ha encontrado ningún efecto. Esto ha sido explicado mediante un estudio por microscopía electrónica de transmisión con tomografía, donde se han observado diferencias en la forma en la que los EPS soportan las AuNPs, siendo el caso de los prismas de oro el único en el que el espacio entre partículas está disponible para albergar las moléculas de rodamina B y por tanto aumentar su señal Raman. Por último, en el séptimo capítulo, se recogen las conclusiones generales de esta tesis doctoral. En ellas se realiza un resumen de todo el trabajo realizado y se exponen y comentan los resultados más significativos. SUMMARY (English) In this doctoral Thesis, the investigation of the specific aspects of the chemical machinery of a probiotic bacterium, such as Lactobacillus fermentum, which is very common in different floras of the human body, is intended. In particular, the Thesis is focused on exploring the bacterium's reducing activity and its capacity to generate biofilms through the formation of exopolysaccharides (EPS). The acquired knowledge is employed to address some health problems in which this bacterium is directly or indirectly implied. The experimental results obtained and their discussion are presented in this report divided into 7 chapters. In the first chapter, the basic concepts of the research topic in which the present Thesis is defined and its motivation in the current context are reviewed. A bibliography review regarding the use of microorganisms for the synthesis of metallic nanoparticles is performed, concretely and more specifically, the use of the EPS in different biotechnological and biomedical applications. Furthermore, these EPS have been proposed as platforms for the preparation of new nanomaterials with improved optical properties. Finally, the Lactobacillus fermentum strain is presented and the main applications in nutrition and medicine of this probiotic are reviewed. In the second chapter, the reducing activity of L. fermentum is evaluated by using an electrochromic polyoxometalate which changes from pale yellow to powerful blue when it is reduced. From this simple methodology, it has been able to demonstrate that the reducing activity of L. fermentum is correlated with its metabolic strength. Thus, when the bacterium is in an optimal culture media, it produces the reduction of this polyoxometalate, whereas in a poor media, this reducing power significantly decreases. Therefore, this methodology allows the evaluation of the probiotic's presence and strength in different chemical environments, and also studying the effect of some drugs against this probiotic. In particular, the effect of omeprazole and vancomycin has been evaluated against the viability of this probiotic. Omeprazole is a massive used drug for ulcer and gastritis treatment, and vancomycin, one of the antibiotics broadly more consumed. There has always existed a doubt around these two drugs regarding whether or not its usual consumption damages the bacterial flora at the intestinal level. In this sense, the results expose that omeprazole has not any effect against the reducing capacity of L. fermentum, and in consequence its strength. However, vancomycin decreases the reducing power of L. fermentum up to practically insignificant levels, which provokes death or serious damage to this strain. In the third chapter, the idea that the stoppage of the metabolic activity of the bacteria provokes a decrease of excreted metabolites in the media, is extended to develop a sensor for the diagnosis of bacterial vaginosis. This infection affects approximately 10-15% of women in the general female population. In this, the typical vaginal flora, which is constituted of lactobacillus bacteria and excretes lactic acid out to the media, is altered by the growth of pathogenic anaerobic bacteria that excrete short chain fatty acids out, being the acetic acid the most abundant. The current diagnosis methods are based on the sample gathering to detect the presence of possible pathogenic bacteria, which requires time and a huge cost and difficulty. A diagnosis method based on the detection of the typical excreted metabolites by the bacteria has been developed. The change of colour from yellow to blue of an electrochromic polyoxometalate when it is reduced in a sample containing lactic acid and after using ultraviolet light, is the signal that indicates the state of the vaginal flora. The intensity of the colour is higher when higher is the acid concentration and thus more 'healthy' is the sample. Therefore, a faster, cheaper and easier diagnosis method than the current approaches has been designed. In the fourth chapter, a vital step towards understanding why probiotic bacteria increase iron absorption in the gastrointestinal tract has been taken. Reduction of Fe(III) to Fe(II) is essential for iron absorption in the duodenum. It has been determined that the ferric-reducing activity of L. fermentum is due to an excreted molecule, p-hydroxyphenyllactic acid (HPLA), by this bacteria. By reducing Fe(III), HPLA boosts Fe(II) absorption through the DMT1 channels of enterocytes. Thus, HPLA would be acting in the same way that the ferric-reducing protein DcytB, a membrane protein that is linked to the DMT1 channels in the enterocyte, does. HPLA has been isolated from the supernatant of a L. fermentum culture by the employment of high resolution liquid chromatography and afterwards has been characterized using nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy techniques. In a secondary step, several experiments have been carried out, among them an in vitro experiment, to confirm that probiotics increase the Fe absorption in the gastrointestinal tract due to the excretion of HPLA. These results have allowed, for the first time, to propose a mechanism that explains the reason for probiotic to promote iron absorption. This discovery opens new avenues for the treatment of iron deficiency in humans, one of the most common and widespread nutritional disorders in the world. In the fifth chapter, the identification of the EPS that compound the biofilm of L. fermentum has been carried out. EPS are the main components of a bacterial biofilm and they are highly implied in the development of the bacterial functions. In the case of probiotic bacteria, EPS are related with the epithelial adhesion and colonization of these bacteria, a fundamental process needed in the beneficial role of the probiotic for the human health. After isolating and purifying EPS, synthesized in a culture where sucrose is the carbon source, their identification by employing nuclear magnetic resonance has been carried out. In this way, it has been determined that EPS of L. fermentum in these culture conditions are two homopolysaccharides: dextran and levan. Dextran is a glucose polymer and levan a fructose one. Both polymers have properties of interest for biotechnological applications in food and pharmaceutical industries. In the sixth chapter, it has been taken advantage of the EPS of L. fermentum as a platform to support gold nanoparticles (AuNPs). Spherical, rods and prisms nanoparticles aggregate when deposited onto EPS. Moreover, EPS of L. fermentum produce gold aggregates from a Au(III) solution on their own. UV-vis spectra of aggregated AuNPs shows new absorbance peaks, together with the typical band of the surface plasmon resonance (SPR) of gold nanoparticles. For example, in the case of gold nanoprisms, the new absorption band appears at a very low energy centered at 1100 nm. This fact increases the interest of the optical properties of these systems. By using transmission electron microscopy it has been confirmed the AuNPs aggregation onto EPS. At the same time, it has been carried out a SERS experiment to increase the Raman signal of deposited rhodamine B (a model molecule for this type of studies) over isolated AuNPs by using these AuNPs-EPS systems. In the case of gold nanoprisms onto EPS, a rhodamine Raman signal intensity two times higher has been observed, whereas no effect has been found with the other types of AuNPs. This fact has been explained by a transmission electron microscopy tomography study where several differences in the way in which AuNPs are deposited onto the EPS have been observed. Only the gold nanoprisms aggregate, in which gold interparticle surfaces were exposed to RhB, showed a drastic increase of intensity in the Raman spectrum of RhB. Finally, in the seventh chapter, the general conclusions of this Doctoral Thesis are included. In them, all the work and the most significant results are exposed, discussed and summarized.