Estudio de la variabilidad genética del VHC y la respuesta inmune del hospedador en los pacientes tratados con interferón pegilado y ribavirina. Bases racionales para la obtención de una vacuna terapéutica

Resumen

TÍTULO: Estudio de la variabilidad genética del VHC y la respuesta inmune del hospedador en los pacientes tratados con Interferón Pegilado y Ribavirina. Bases racionales para la obtención de una vacuna terapéutica. INTRODUCCIÓN: En la actualidad, según la OMS, datos de julio de 2017, se calcula que en el mundo hay unos 130-150 millones de personas que padecen la infección crónica por el VHC y más de 500.000 enfermos mueren al año por afecciones hepáticas vinculadas al mismo, siendo el VHC la causa más frecuente de hepatitis crónica en los países desarrollados (Lozano et al., 2012). La prevalencia de la infección por el VHC a nivel mundial es aproximadamente del 3 % con una gran variabilidad geográfica, siendo por países Egipto el que tiene mayor incidencia (>10 %). En nuestro país se estima que existen unas 800.000 personas infectadas (aproximadamente el 1,8 % de la población). Se sabe que tanto los factores virales como los factores del hospedador pueden cambiar la historia natural de la enfermedad y la respuesta terapéutica (Feld et al., 2005). La respuesta al tratamiento depende de la variabilidad genética viral (Salmerón et al., 2006; Salmeron et al., 2008; Muñoz de Rueda et al., 2008), aunque los factores que predicen la RVS son sobre todo el genotipo y la carga viral; sin embargo, hay pacientes con el mismo genotipo y una carga viral parecida que presentan un tipo de respuesta diferente. La posibilidad de que los parámetros genéticos e inmunológicos puedan influir y predecir la respuesta al tratamiento ha despertado un gran interés en estos últimos años. También una efectiva presentación de los antígenos virales a las células T CD4+ y CD8+ por los HLA de clase II y clase I, respectivamente, es la clave de una óptima regulación de la respuesta inmune frente a las infecciones virales. Aunque la patogénesis de la infección por VHC no se conoce del todo, se sabe que el aclaramiento viral espontaneo se asocia con una gran proliferación de las células T CD4+ a la vez que los pacientes que se cronifican presentan una menor respuesta de las células T (Kaplan et al., 2004). Por otro lado se ha estudiado la correlación entre los alelos HLA y el aclaramiento espontáneo de la hepatitis aguda C, siendo muchos los alelos HLA encontrados, en especial el DQB1*0301 y el DRB1*11. De hecho hay un metanálisis publicado en el año 2005 que demuestra que ambos alelos están relacionados con el aclaramiento viral espontáneo (Hong et al., 2005). Nosotros en un anterior proyecto hemos estudiado a 428 pacientes tratados con IFN-peg+RBV, de los cuales 277 eran genotipo 1 y en los cuales el 69 % de los pacientes que presenta el alelo de clase II DQB1*0301 presentaban RVS frente a una respuesta menor del 50 % en los que no prestaban dicho alelo. Por tanto, partiendo de la premisa de que los pacientes con genotipo 1 que expresan el alelo DQB1*0301 tienen una probabilidad del 69 % de responder, nos preguntamos qué ocurre con los pacientes que aún presentando este alelo no responde al tratamiento antiviral. Hemos encontrado que el alelo DQB1*0301 se une a una zona de 20 aminoácidos de la región NS3 del VHC (aa 1253-1272; GYKVLVLNPSVAATLGFGAY) (Lamonaca et al., 1999), siendo un epítopo inmunodominante promiscuo, ya que también se une, aunque con menor afinidad, a otras moléculas HLA clase II del tipo DRB1*. HIPÓTESIS: Nuestra hipótesis plantea que el 69 % de los pacientes que poseen el alelo DQB1*0301 y presentan RVS al tratamiento antiviral con IFN-peg+RBV responden debido a que la secuencia aminoacídica del epítopo inmunodominante del VHC (NS3 aa 1253-1272) se encuentra en su forma salvaje (no mutada). En cambio, este epítopo se encuentra mutado en el 31 % de los pacientes que tienen el alelo y no responden al tratamiento combinado, lo cual impiden su correcta unión a la molécula de HLA. OBJETIVOS: Para comprobar nuestra hipótesis en este estudio nos hemos marcado como objetivos: - Estudiar el papel que juega la variabilidad genética, mediante pirosecuenciación, del epítopo inmunodominante (NS3 aa 1253-1272) del VHC, en la resistencia al tratamiento con IFNpeg-RBV en los pacientes con HCC genotipo 1 que expresan el alelo HLA de clase II DQB1*0301. - Comprobar mediante citometría de flujo, en estudios in vitro, si el epítopo inmunodominante salvaje es capaz de generar una proliferación de las células CD4+ en los pacientes con RVS y NR DQB1*0301 positivos, mientras que un péptido sintético mutado no es capaz de generar esta respuesta en ninguno de los grupos anteriores. Con este objetivo se pretende en un futuro obtener una “vacuna terapéutica” para los pacientes que presentan el alelo DQB1*0301. RESULTADOS: Del total de los 100 pacientes disponibles DQB1*0301 procedentes de un estudio anterior, se pirosecuenció la región viral NS3 (1253-1772) de 40 pacientes de los que se disponía suero basal congelado a -80ºC, cuya secuencia patrón se seleccionó de una base de datos de secuencia pública (http://hcv.lanl.gov/; número de acceso de GenBank AF009606). Se pirosecuenciaron un total de 50 muestras de suero basal de todos ellos y suero de muestras recogidas durante el tratamiento y al finalizar el mismo en aquellos pacientes no respondedores. De las muestras de los 40 pacientes pirosecuenciados, solo amplificaron totalmente y de forma correcta las muestras de 37 pacientes. El haplotipo mayoritario fue la secuencia de tipo salvaje pero además se encontraron 33 haplotipos mutados, 19 fueron específicos para el grupo de pacientes sin RVS, solo 4 para pacientes con RVS y 10 para ambas respuestas, encontrándose 4.75 veces más haplotipos mutantes diferentes que en el grupo de pacientes con RVS que en los no-RVS. También se asociaron tres sitios polimórficos con los pacientes sin RVS: haplotipo 7, aa5 (L5P); haplotipo 11, aa7 (L7P); y haplotipo 15, aa15 (L15S). Se realizó una segunda parte del estudio para comprobar si las sustituciones de aminoácidos observadas en el epitopo NS31253-1272 inmunodominante del alelo HLA-DQB1*0301 habían producido un escape de la respuesta de las células T CD4+, evaluando el impacto de los cambios de aminoácidos, individualmente o en conjunto, con respecto a su capacidad para estimular células T CD4+, aislando las propias células de los pacientes. Del total de los 37 pacientes cuyas muestras fueron amplificadas totalmente, para incluirlos en el estudio de cultivos in vitro debían ser pacientes que no hubiesen comenzado un nuevo tratamiento (en el caso de no SVR) y deberían ser contactables (ya que era necesario disponer de sangre fresca para realizar el estudio). De estos 37 pacientes, solo 7 cumplían estas condiciones, 3 SVR y 4 no-SVR. Se recolectó sangre periférica completa de cada paciente mediante punción venosa y posteriormente se realizó el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante la técnica Ficoll Histopaque-1077. Se sintentizaron nueve péptidos sintéticos correspondientes a los haplotipos salvaje (wt), péptidos H7, H11 y H15 (correspondientes a los haplotipos 7, 11 y 15) que se asociaron directamente con la falta de respuesta y otros 5 haplotipos encontrados en los pacientes del estudio. Las células T se expandieron en tubos de fondo redondo de 15 ml a una concentración celular de 1 x 106 células / ml. Se realizaron tres repeticiones para cada uno de ellos, y el procedimiento se llevó a cabo en las mismas condiciones para cada paciente, utilizando PBMC, previamente almacenadas en nitrógeno líquido, marcadas con CFSE 50 μM. Después de cinco días de cultivo, las PBMC se lavaron una vez con PBS al 1% de BSA y se incubaron con anti-CD4 PE durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego se lavaron dos veces con PBS 1x + FBS al 0,5% y se analizaron usando un citómetro de flujo FACSAria Becton Dickinson II. De acuerdo con nuestra hipótesis de estudio, los péptidos mutados no produjeron un aumento en la proliferación de las células T CD4 + en cuatro de los siete pacientes, en los cuales sí se produjo estimulación por parte del péptido salvaje. Debido a que no se produjo el efecto deseado en todos los pacientes, los pacientes se dividieron en dos grupos, el Grupo 1, compuesto por cuatro pacientes que sí cumplían la hipótesis, y el Grupo 2, que contenía los pacientes que no confirmaron la hipótesis. La principal diferencia observada entre el Grupo 1 y el Grupo 2 de pacientes fue que aquellos que coincidían con el patrón esperado presentaban valores más bajos con el control negativo que el grupo que no coincidía con el, lo que sugiere que hay un menor nivel de tolerancia inmune en los pacientes del Grupo 2. Este grupo 2 de pacientes presentó altos niveles basales de estimulación y, por lo tanto, no era probable que alcanzara la proliferación de CD4 + con la estimulación con péptido. CONCLUSIONES: De nuestro estudio podemos concluir que los pacientes sin RVS tienen 4,75 veces más haplotipos mutados que los pacientes con RVS, además de que los pacientes con RVS tienen menor número de haplotipos, un número promedio menor de mutaciones por haplotipos y menos sitios polimórficos en el conjunto de haplotipos que los pacientes con no-RVS. Es de gran importancia continuar estudiando las mutaciones de regiones conservadas como NS3, ya que además de ser una región altamente conservada, esta es un área en la que se requieren ciertos epítopos inmunodominantes como el descrito en nuestro estudio para producir una respuesta inmune adecuada. Por tanto probablemente sea relevante en el uso prolongado de los DAAs, ya que la presencia de estos polimorfismos puede impedir la respuesta completa del paciente, aunque la tasa de respuesta de los nuevos DAA sea muy alta. REFERENCIAS: Feld JJ and Hoofnaglr JH. Mechanism of action of interferon and ribavirin in treatment of hepatitis C. Nature, 2005;436:967-972. Hong, X., et al., Human leukocyte antigen class II DQB1*0301, DRB1*1101 alleles and spontaneous clearance of hepatitis C virus infection: a meta-analysis. World J Gastroenterol, 2005. 11(46): p. 7302-7. Kaplan DE, Sugimoto K, Newton K, et al. Discordant role of CD4 T-cell response relative to neutralizing antibody and CD8 T-cell responses in acute hepatitis C. Gastroenterology 2007; 132:654-666. Lamonaca, V., et al., Conserved hepatitis C virus sequences are highly immunogenic for CD4(+) T cells: implications for vaccine development. Hepatology, 1999. 30(4): p. 1088-98. Lozano, R., et al., Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet, 2012. 380(9859): p. 2095-128. Muñoz de Rueda P, J. Casado, R. Patón, et al. Mutations in E2-PePHD, NS5A-PKRBD, NS5AISDR, and NS5A-V3 of Hepatitis C Virus Genotype 1 and Their Relationships to Pegylated Interferon-Ribavirin Treatment Responses. J.Virol, 2008;82(13):6644–6653. Salmerón J, Casado J, Muñoz de Rueda P, et al. Quasispecies as predictive factor of rapid, early and sustained virological responses in chronic hepatitis C, genotype 1, treated with peginterferon-ribavirin. J Clin Virol. 2008 Apr;41(4):264-9. Salmeron J, Muñoz de Rueda P, Ruiz-Extremera A, et al., Quasispecies as predictive response factors for antiviral treatment in patients with chronic hepatitis C. Dig Dis Sci. 2006 May;51(5):960-7. Yee LJ. Host genetic determinants in hepatitis C virus infection. Genes Immun 2004; 5: 237-245