Caracterización de una peroxirredoxina cloroplastídica de pisum sativum

Résumé

En los últimos años, y en todos los reinos, se ha descrito un nuevo tipo de enzimas, las Peroxirredoxinas (Prx), capaces de intervenir en los sistemas de destoxificación de las especies de oxígeno reactivo reduciendo el H2O2 y distintos alquilhidroperóxidos. En vegetales superiores una de las enzimas pertenecientes a esta familia, la peroxirredoxina de dos cisteínas (Prx de 2-Cys), se localiza en el cloroplasto donde parece estar involucrada en procesos de gran importancia como la protección de la fotosíntesis, la destoxificación de H2O2 a nivel del ciclo agua-agua, la protección de los tilacoides y también en procesos de señalización celular. En el estudio presentado en esta Tesis Doctoral se ha aislado el cDNA que codifica la Prx de 2-Cys de Pisum sativum mediante PCR. El cDNA aislado codifica una enzima con gran similitud a Prx de 2-Cys descritas en otros organismos presentando las dos cisteínas características de este tipo de enzimas así como los motivos peptídicos conservados alrededor de ellas, igualmente presenta otros aminoácidos esenciales para la actividad de estas enzimas. Se ha sobreexpresado la proteían recombinante en E.coli utilizando el sistema de expresión pET. La proteína recombinante se purificó y se llevó a cabo una caracterización cinética exhaustiva, así como la determinación de ciertas características físico-químicas. Se determinó que la enzima prsenta dos conformaciones distintas, dimérica y decamérica, favoreciéndose esta segunda por la fuerza iónica del medio, el estado redox de la enzima, el pH bajo y el anión fosfato. Se ha demostrado la actividad antioxidante de la enzima presentando propiedades comparables a las descritas para otras enzimas similares y se ha visto que se reduce por Tiorredoxina (Trx) y ciclofilina. Mediante inmunocitoquímica se ha confirmado la localización cloroplastídica de la Prx de 2-Cys de P.sativum, dentro del cloroplasto la enzima se localiza f