Caracterización, purificación y evaluación de la bioactividad de fitoquímicos obtenidos de fuentes naturales

Resumen

RESUMEN La presente Tesis Doctoral recoge herramientas de análisis, purificación y evaluación de la bioactividad de los compuestos fenólicos presentes en distintas especies vegetales, así como los resultados obtenidos tras la aplicación de todas ellas. Para describirlos, esta memoria se ha dividido en dos grandes secciones: introducción y parte experimental. En la INTRODUCCIÓN se recoge información, en primer lugar, sobre la relación entre alimentación y salud a lo largo de los años y se detallan las principales características de las matrices vegetales que han sido objeto de estudio: Sclerocarya birrea (marula), Eryngium bourgatii, Camellia sinensis, Pinus pinaster, Vitis vinifera, Theobroma cacao y Lippia citriodora (hierbaluisa). A continuación, se describen los compuestos fenólicos, las rutas de donde surgen, su estructura y clasificación, para posteriormente centrarse en las etapas del proceso analítico como son la obtención, purificación y determinación de estos compuestos. Por último, se hace un recorrido por la bioactividad de los compuestos fenólicos, prestando especial atención a su papel como antioxidantes y antiinflamatorios y, también, a su relación con ciertas patologías como son la obesidad y las enfermedades raras de tipo esquelético. Además, se describen ensayos que permiten evaluar estos efectos beneficiosos. En la PARTE EXPERIMENTAL se incluyen todos los trabajos que han sido llevados a cabo a lo largo del periodo de formación predoctoral y que está dividida a su vez en dos bloques. El Bloque 1 está enfocado en la obtención, determinación y purificación de los compuestos fenólicos contenidos en las matrices vegetales contenidas en los distintos trabajos. Y el Bloque 2, por su parte, está dirigido a la determinación de la bioactividad de estos compuestos. Dentro del Bloque 1, el Capítulo 1 trata de la obtención de extractos ricos en compuestos fenólicos a partir de corteza de S. birrea mediante distintos sistemas de extracción tanto convencionales (SLE) como no convencionales (PLE y SFE) y, además, usando disolventes GRAS (agua y etanol). La identificación tentativa de los compuestos fenólicos presentes en cada uno de los extractos obtenidos se llevó a cabo mediante la plataforma analítica HPLC-ESI-TOF-MS, encontrando compuestos que no habían sido descritos previamente en esta matriz. El Capítulo 2 se realizó en colaboración con la Unitat de Recerca Biomèdica de la Universidad Rovira i Virgili en Reus (Tarragona, España), y se centra en el estudio de los compuestos fenólicos con capacidad antioxidante y antiinflamatoria contenidos en las hojas y flores del cardo E. bourgatii. La obtención de los extractos se llevó a cabo mediante SPE y la composición de su fracción fenólica fue determinada por primera vez mediante HPLC-ESI-QTOF-MS/MS. Siguiendo con la búsqueda de compuestos bioactivos, esta misma herramienta analítica fue utilizada en los Capítulos 3 y 4 para la identificación de polifenoles, sobre todo proantocianidinas, de extractos comerciales de corteza de pino, té verde, semilla de uva y cacao. Además, se evaluó el contenido de polifenoles y flavan-3-oles totales por los métodos Folin-Ciocalteu y Vainillina, respectivamente, así como su capacidad antioxidante por los métodos FRAP, TEAC y ORAC. En el caso de la semilla de uva y el cacao (Capítulo 4), además se realizaron ensayos de capacidad antiinflamatoria en colaboración con la Unitat de Recerca Biomèdica de la Universidad Rovira i Virgili en Reus (Tarragona, España), con el objeto de evaluar la relación estructura-actividad de las procianidinas típicas del cacao y de las proantocianidinas con derivados de ácido gálico, más típicas de la uva y del té verde. Ya los Capítulos 5 y 6 se centraron más en el estudio de distintas metodologías para la purificación de los compuestos fenólicos del cacao. Técnicas como la extracción en fase sólida, la HPLC semi-preparativa o el uso de membranas de micro-, ultra- y nano-filtración han servido para obtener extractos con un número más reducido de compuestos hasta llegar a fracciones purificadas. En el caso de la separación por membranas, esta metodología se llevó a cabo en colaboración con el Instituto de Biotecnología de la Universidad de Sfax (Túnez). Los compuestos contenidos en cada uno de los extractos obtenidos se determinaron mediante HPLC-ESI-TOF-MS y se evaluó su toxicidad para posteriores ensayos de bioactividad. El Bloque 2 se centra en el estudio de la bioactividad de los compuestos fenólicos. Para ello, los Capítulos 7 y 9 ofrecen una amplia visión de los efectos beneficiosos para la salud que ofrecen los compuestos fenólicos contenidos en L. citriodora (Capítulo 7) y las proantocianidinas (Capítulo 9) características de matrices como la corteza de marula, el té verde, la corteza de pino, la semilla de uva y el cacao. Siguiendo en la línea de la determinación de la bioactividad, el Capítulo 8 recoge los resultados de un estudio realizado en colaboración con el Instituto de Biología Molecular y Celular (IBMC) de la Universidad Miguel Hernández de Elche (Alicante, España), donde se evalúa el efecto de los compuestos fenólicos purificados por HPLC semi-preparativa de L. citriodora en la obesidad a través de la modulación de la AMPK, siendo el verbascósido el que presentó mayor capacidad de activación. Algunos de los compuestos identificados, como la diooflavona o el iridoide shanzisido metil éster entre otros, fueron encontrados por primera vez en esta planta. El Capítulo 10, que fue realizado en colaboración con la Unitat de Recerca Biomèdica de la Universidad Rovira i Virgili en Reus (Tarragona, España), se centra la atención en la evaluación del efecto de compuestos fenólicos que pertenecen a distintas familias en modelos de oxidación y de inflamación, para comprobar si se producen interacciones en el metabolismo energético. Para ello, se seleccionaron extractos de cacao, por ser rico en monómeros y polímeros de flavan-3-oles, y de L. citriodora por ser rica en fenilpropanoides, iridoides y otros flavonoides distintos a los presentes en el cacao, y se utilizó la herramienta analítica GC-EI-QTOF-MS para hacer el seguimiento de los intermediarios. Se vio que el cacao producía efecto parcial reparador en modelos de oxidación y la hierbaluisa en modelos de inflamación, aunque ambos extractos demostraron efectos beneficiosos en los dos modelos. En el Capítulo 11 se recoge toda la información contenida en una patente realizada entre la Universidad de Granada y el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) de París (Francia) que describe el efecto de la (-)-epicatequina contenida en una fracción purificada de T. cacao para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con el receptor tirosina quinasa como puede ser la acondroplasia. Por último, parte de los trabajos experimentales realizados en los Capítulos 10 y 11 se desarrollaron en diferentes estancias realizadas en la Unitat de Recerca Biomèdica de la Universidad Rovira i Virgili en Reus (Tarragona, España) y en el Institute Imagine/INSERM de París (Francia), respectivamente. SUMMARY The present doctoral dissertation encompasses different analytical approaches for identification, isolation and evaluation of bioactivity of phenolic compounds from natural sources. In order to describe them, this manuscript has been divided into two main parts: introduction and experimental section. The INTRODUCTION presents noteworthy information concerning the relationship between food and health along the years and the main features of plants under study (Sclerocarya birrea (marula), Eryngium bourgatii, Camellia sinensis, Pinus pinaster, Vitis vinifera, Theobroma cacao and Lippia citriodora (lemon verbena)). Afterwards, chemical structure and classification of phenolic compounds are described as well as the different stages of an analytical procedure for obtaining, isolating and determining phenolic compounds used in the experimental section. Finally, their role as bioactive compounds is also included in this part, focusing on their antioxidant and antiinflamatory activities and their relationship with different diseases as obesity and skeletal disorders. The EXPERIMENTAL PART includes all studies that has been carried out during the PhD and is sub-divided in two sections. Section 1 focuses on the analytical procedure compiling obtainment, determination and isolation of phenolic compounds from selected vegetables. And, Section 2 provides an extensive information about methods for bioactivity evaluation of these compounds. In Section 1, Chapter 1 concerns the obtainment of phenolic-enriched extracts, suited for food applications, from S. birrea bark by conventional (SLE) and non-conventional (PLE and SFE) extraction systems and, in addition, using GRAS solvents (water and ethanol). The tentatively characterization of the phenolic compounds from each extract was carried out by HPLC-ESI-TOF-MS, where we found compounds which were identified for first time in marula bark. Chapter 2 deals with the characterization of phenolic compounds with antioxidant and anti-inflammatory activities from E. bourgatii (leaves and inflorescences). The extraction process was carried out by SPE and this was the first phenolic composition identification of E. bourgatii by HPLC-ESI-QTOF-MS/MS. This work was conducted in collaboration with the Biomedical Research Centre of Rovira i Virgili University from Reus (Spain). As a continuation of the search of bioactive phenolic compounds plant sources, the same analytical approach for identification of polyphenols, above all proanthocyanidins, from pine bark, green tea, grape seeds and cocoa commercial extracts, was applied in Chapters 3 and 4. Moreover, the total phenolic compounds and flavan-3-ols were determined by Folin-Ciocalteu and Vanillin assays respectively, as well as the antioxidant capacity by FRAP, TEAC and ORAC assays. In case of grape seed and cocoa (Chapter 4), anti-inflammatory assays were also carried out, in collaboration with the Biomedical Research Centre of Rovira i Virgili University from Reus (Spain), in order to study the structure-activity relationship of procyanidins commons in cocoa and galloyl-derived proanthocyanidins from grape seeds or green tea. In Chapters 5 and 6, different approaches for isolation such as solid phase extraction, semi-preparative HPLC or micro-, ultra- and nano-filtration membranes, were performed in order to obtain extracts with different phenolic composition and purity from T. cacao. In case of membrane separation, this methodology was performed in collaboration with Biotechnology Institute of Sfax University (Tunisia). This characterization was made by HPLC-ESI-TOF-MS and their toxicity was evaluated for subsequent bioactivity assays. Section 2 deals with the study of bioactivity of phenolic compounds in selected plants. For this reason, Chapters 7 and 9 provide a large perspective about beneficial effects on health of phenolic compounds from L. citriodora (Chapter 7) and common proanthocyanidins (Chapter 9) from marula, green tea, pine bark, grape seeds and cocoa. In this way, Chapter 8 encompasses the results of a work, which was prepared in collaboration with the Institute of Molecular and Celular Biology (IBMC) of Miguel Hernández University from Elche (Spain), where the effect of purified phenolic compounds by semi-preparative HPLC from lemon verbena extract was evaluated in obesity model though the AMPK modulation. In this case, verbascoside presented the highest capacity of AMPK activation. Some of the identified phenolic compounds as diooflavone and an iridoid shanziside methyl ester, among others, were detected for first time in this extract. Chapter 10, which was performance in collaboration with the Biomedical Research Centre of Rovira i Virgili University from Reus (Spain), is focused on the evaluation of the effect of phenolic compounds from different families related with their chemical structures in oxidation and inflammatory models. The aim of this chapter was to study the interactions in the intermediates of energy metabolism. For this purpose, T. cacao and L. citriodora extracts were selected for being procyanidins monomers and polymers enriched in case of cocoa and phenylpropanoids, iridoids and other flavonoids enriched in case of lemon verbena. As an analytical tool, GC-EI-QTOF-MS was applied for monitoring the intermediates. Interestingly, it was noticed that T. cacao provided best results in oxidation model and L. citriodora in inflammation one, although both extracts showed positive effects in these two scenarios. Chapter 11 compiles all data from a patent in agreement between University of Granada and National Institute of Biomedical Research and Human Health INSERM from Paris (France). This study describes the effect of (-)-epicatechin of purified fraction from T. cacao in the prevention or treatment of tyrosine-kinase receptor related disorders as achondroplasia. Lastly, the studied in Chapters 10 and 11 were partially conducted during different stays in the Biomedical Research Centre of Rovira i Virgili University from Reus (Spain) and Institute Imagine/INSERM from Paris (France), respectively.