Estudio de la actividad funcional de los microarns en cáncer de pulmón. Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas

Resumen

El complejo SWI/SNF es capaz de alterar las interacciones de ADN-histonas, modificando la accesibilidad de la información contenida en el ADN a la maquinaria celular. Los esfuerzos llevados a cabo en los últimos tiempos para identificar alteraciones en el genoma cancerígeno mediante secuenciación han puesto de manifiesto cómo este complejo tiene un papel supresor tumoral muy relevante siendo, de entre los complejos remodeladores de la cromatina, el que se encuentra más mutado en gran variedad de tipos de cánceres. SMARCA4 es la subunidad catalítica del complejo. En el caso concreto del cáncer de pulmón esta subunidad se ha encontrado que inactiva su expresión mediante mutaciones recurrentes en el caso de líneas celulares. En tumores primarios, se ha encontrado también una pérdida de expresión, pero esta no puede ser explicada mediante la presencia de mutaciones lo que implica que deben de existir mecanismos alternativos de inactivación de la expresión. Estudios previos descartaron la hipermetilación del promotor de SMARCA4, por lo que el silenciamiento de SMARCA4 observado en cáncer debe estar mediado por otro mecanismo. Una de las posibles opciones para dicho silenciamiento es la actividad de microARNs. Con el fin de estudiar la regulación de SMARCA4 por parte de los microARNs, se identificó experimentalmente la secuencia de la región 3’ no traducida (3’UTR) del gen encontrándose dos secuencias de diferente tamaño: una de 242 nucleótidos, y otra extendida que contenía a la anterior de 466 nucleótidos. Utilizando diferentes algoritmos de predicción se seleccionaron 4 microARNs (miR-7, miR-101, miR-199 y miR-155) con posibles sitios de unión en la 3’UTR de SMARCA4 sobre los que desarrollar estudios experimentales. Ensayos de luciferasa determinaron que miR-101, miR-199 y miR-155 eran capaces unirse a la 3’UTR larga e inhibir la expresión de SMARCA4 mientras que únicamente miR-155 era capaz de unirse a la 3’UTR corta. Todo esto fue confirmado alternativamente sobre-expresando el microARN estudiado y midiendo los niveles de expresión de proteína nativa de SMARCA4 mediante western-blot. Enfocándonos en miR-155, por ser capaz por sí mismo de regular a SMARCA4 sea cual sea la 3’UTR presente, comprobamos que al inhibir este microARN los niveles de SMARCA4 aumentaron y al mutar su sitio de unión en la 3’UTR este efecto desaparece. Esto nos hizo concluir que miR-155 ejerce su papel de forma directa uniéndose a la 3’UTR de SMARCA4. También pudimos comprobar que la actividad oncogénica de miR-155 está relacionada con su papel como inhibidor de SMARCA4. Finalmente, estudiando una serie de tumores primarios de pulmón mediante PCR cuantitativa pudimos observar que existe una correlación inversa entre los niveles de miR-155 y de SMARCA4, observación que se hace extensible cuando hemos reanalizado los datos de expresión de otra serie de pacientes estudiada por laboratorios independientes. Dado que en tumores primarios de pulmón se conoce que miR-155 aumenta su expresión, nuestros resultados sugieren que podría contribuir al silenciamiento de la expresión génica de SMARCA4. Por otra parte, utilizando los conocimientos adquiridos sobre la actividad biológica de los microARNs en el desarrollo experimental previamente expuesto, planteamos la posibilidad de utilizar la actividad reguladora de los microARNs para dirigir la expresión de un gen suicida a las células tumorales. Uno de los sistemas de genes suicidas más estudiado es el del virus del Herpes simple timidinquinasa/Ganciclovir (HSV-TK/GCV). Utilizando una 3’UTR artificial con sitios de unión para la familia de microARNs let-7, un marcador tumoral que se pierde durante el desarrollo tumoral en cáncer de pulmón, pudimos dirigir la expresión de HSV-TK preferencialmente a las células tumorales, que presentan niveles reducidos de let-7. Una vez comprobada la funcionalidad de esta construcción pueden plantearse mejoras del sistema así como su uso terapéutico en otros tipos de cánceres.